[发明专利]一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用

说明书

本发明涉及一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用，将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。所述的贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示的序列。所述的两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、7、8或9所示的序列。所述第三嵌段多肽包含SEQ ID NO.10(RGD短肽)、11(SDE三肽)、12(IKVAV短肽)或13(RADA16‐I自组装多肽)所示的序列。实现了微生物一步法合成融合蛋白，该过程温和高效，成本低廉，设备要求度低，易于后期扩大生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的基因合成、含有融合蛋白基因片段的重组表达载体的构建、在基因工程菌株中的发酵表达、融合蛋白的分离纯化方法、及其在材料修饰方面的应用。

背景技术

生物污损，是指细胞、蛋白质、细菌等生命物质在固体基底表面发生附着、积累、繁殖所导致的材料或器件性能退化，造成器件损耗的过程。在医药、航海、食品等领域，生物污损不仅会增加材料的损耗，还会造成能源消耗、医疗安全等诸多问题。如在免疫诊断行业，生物芯片表面的非特异性蛋白吸附会减弱设备的信噪比，降低检测的精准度；在医疗领域，生物污损造成的危害尤为严重，如人工心脏瓣膜、心脏起搏器、血液透析系统、血管支架、植入导管、人工骨等器件在人体中直接接触组织和体液，由于细菌的粘附以及蛋白质、细胞的吸附，很容易形成生物膜，甚至引起更严重的感染性并发症。因此，构建具有抗污功能的防止生物污损的材料表面具有非常重要的应用价值。

为了在基体材料表面制备有效的抗污涂层，需要将抗污蛋白稳定的连接到材料表面上。近年来，通过对自然界中生物粘附现象的观察和探索，特别是对海洋贻贝足丝蛋白(Mytilus edulis foot protein,Mefp)的研究，开发基于贻贝黏附蛋白的具有广泛适用性的修饰技术已成为研究热点。其中，Mefp蛋白含有大量的3,4-二羟基苯丙氨酸(Dopa)，Dopa的强共价键和配位能力赋予贻贝黏附蛋白超强的黏附力。Dopa作为酪氨酸翻译后修饰的羟基化合物，是一种非天然氨基酸，微生物不能直接合成含Dopa的多肽或蛋白，可以通过翻译后修饰或非天然氨基酸插入的方法获得。

在抗污材料方面，两性离子聚合物(同时含有阳离子基团和阴离子基团，整体上呈现电中性)近年来引起研究者极大地关注，由于其离子效应导致的强水合作用，使两性离子材料表面包覆有一层水化层能有效抵抗非特异性蛋白的吸附、细胞粘附及细菌等微生物的粘附。氨基酸，作为一种天然的两性离子分子，也具有类似两性离子聚合物材料的抗污性质。研究发现交替排列的带正电荷的赖氨酸(Lys/K)和带负电荷的谷氨酸(Glu/E)形成的两性离子类多肽自组装成单分子层，具有高效的抗非特异性蛋白吸附能力材料[Chen S,CaoZ,Jiang S.Ultra-low fouling peptide surfaces derived from natural aminoacids.[J].Biomaterials,2009,30(29):5892-5896]。