[发明专利]一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针

说明书

本发明提供一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针，所述引物序列为上游引物：5’‑GCCGTGGTTGATACTA‑3’，下游引物：5’‑CAAGGTCTGCTCGTAA‑3’，所述探针序列为：5’‑CCTTACGCCGCCTGCCATTAC‑3’。本发明根据GenBank登录的AF314503的lktD基因序列，利用Beacon Designer 7.9设计特异性引物和探针，于国内外首先建立溶血性曼氏杆菌lktD基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

技术领域

本发明涉及一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针，属于分子生物学领域。

背景技术

溶血性曼氏杆菌是一种可感染多种家畜和野生动物的条件致病菌，主要感染牛、羊等反刍动物。该菌是牛、羊肺炎及新生羔羊败血症的主要病原，已经严重危害养羊业的健康发展，全球每年约有30%的病死牛与该菌有直接或间接关系，仅北美国家导致的经济损失超过10亿美元。

目前对溶血性曼氏杆菌的病原学诊断技术方面，国内外已有细菌分离鉴定法和普通PCR方法的报道，虽有关于曼氏杆菌属特异性和溶血性曼氏杆菌TaqMan的荧光定量PCR方法，然报道的主要是以16S rRNA为主，未见有关于其它基因荧光定量PCR检测方法的报道。溶血性曼氏杆菌的lktD基因是一个毒力因子，主要作用于反刍动物白细胞。由于细菌分离鉴定法存在耗时较长，且感染早期经抗生素治疗后分离更加困难，并且动物体内多种细菌如多杀性巴氏杆菌、海藻巴氏杆菌等均能抑制该菌的生长，使其分利率远低于实际感染率。普通PCR存在敏感性和特异性较低等缺点，使其在实际应用中受到一定的限制。TaqMan实时荧光定量PCR具有特异性强、定量准确、灵敏度高等优点，尤其适合临床样品的大量检测。本发明的建立可为该菌的病原学检测和流行病学调查提供一种新的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- GCCGTGGTTGATACTA -3’，

下游引物：5’- CAAGGTCTGCTCGTAA -3’。

一种用于检测溶血性曼氏杆菌的探针，所述探针序列为：5’-CCTTACGCCGCCTGCCATTAC-3’。

所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。

利用本发明的引物和探针可用于检测溶血性曼氏杆菌的相应基因进行检测，尤其适用于基于实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR方法。具体操作方法如下：

1、引物设计：根据GenBank上公布的溶血性曼氏杆菌AF314503基因序列，利用BeaconDesigner 7.9 软件对lktD基因序列进行引物和探针设计，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：Premix Ex TaqTM（ProbeqPCR）12.5μL、上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL、探针（10 μmol/L）1.0μL、模板2μL、水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，20s 预变性；95℃ 5s，52.5 ℃ 10s，72℃ 20s 共40 个循环。