[发明专利]一种L-丝氨酸转运蛋白的应用方法

说明书

本发明公开了一种L‑丝氨酸转运蛋白及其应用方法。本发明在研究氨基酸转运蛋白基础上，发现了谷氨酸棒杆菌中NCgl0580序列具有转运L‑丝氨酸功能，将其命名为serE，进一步将serE运用于L‑丝氨酸的生产菌株，用于提高L‑丝氨酸的产量。

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域的技术，具体是一种新的L-丝氨酸转运蛋白SerE及其应用。

L-丝氨酸是一种非必需氨基酸，在医药，食品化妆品等领域有着广泛的应用，其年需求量大约是3000吨。谷氨酸棒杆菌是食品安全级氨基酸生产菌株，广泛应用于L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的生产。然而一般的谷氨酸棒杆菌却不能利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸。

目前国内外对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的研究集中在其合成和降解途径的分子改造，Stolz等以不产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，构建的重组菌以葡萄糖和果糖为混合碳源时L-丝氨酸产量36.2g/L。来书娟等在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中加强表达3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，增加了L-丝氨酸前体3-磷酸甘油酸的合成，提高了L-丝氨酸的产量。

本课题组前期从自然界中筛选得到一株能利用糖质原料发酵产L-丝氨酸的野生型谷氨酸棒杆菌SYPS-062，以它为出发菌株通过多轮化学诱变获得突变株C.glutamicumSYPS-062-33a。该突变株L-丝氨酸产量提高65％，达到11.0g/L，副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的积累量也明显提高。进一步在突变株上解除L-丝氨酸合成途径关键酶反馈抑制，敲除降解途径，阻断和弱化副产物积累途径，所获得重组菌C.glutamicum SYPS-062 33aΔSSA(缩写为ΔSSA)(CGMCC NO.8668)其L-丝氨酸摇瓶产量可以达到26.25g/L，是野生型菌株的3.9倍。

尽管代谢工程改造L-丝氨酸合成和降解途径的基因取得很好的效果，但是为了适用工业规模的生产，目前L-丝氨酸的产量仍需要提高。氨基酸的转运出胞是其在培养基中积累的重要前提，所以为了实现氨基酸大量生产，转运系统受到越来越多的关注。近几十年，在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中，人们鉴定了许多氨基酸转运出胞蛋白，并利用代谢工程将其用于提高氨基酸的产量，例如赖氨酸转运蛋白LysE，苏氨酸转运蛋白ThrE，半胱氨酸转运蛋白EamA，蛋氨酸转运蛋白BrnFE等，但是仅有报道苏氨酸转运蛋白ThrE可以转运丝氨酸。本发明在研究了一些转运蛋白基础上，发现NCgl0580序列具有转运L-丝氨酸功能，将其命名为SerE，进一步研究发现其属于谷氨酸棒杆菌中DMT(drug/metabolite transporter)家族的蛋白。采用基因工程手段，将serE基因在丝氨酸产生菌ΔSSA中敲除或过表达，敲除serE的重组菌L-丝氨酸的产量显著下降，而过表达serE的重组菌L-丝氨酸的产量有提高。

发明内容

本发明提供一种新型L-丝氨酸转运蛋白及其应用方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法。

步骤一，利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组，如下：

SEQ:903bp

其氨基酸序列为：

步骤二，以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，设计基因敲除特异的引物分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段

步骤三，将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌。