[发明专利]一种用于烟草基因编辑素材中总植物碱的高通量连续流动分析方法

说明书

本发明公开了一种用于烟草基因编辑素材中总植物碱的高通量连续流动分析方法，包括以下步骤：A、准确称取0.25g含有总植物碱的样品置于25mL样品管中，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪自动进样器的进样盘上，直至全部放满；B、用移液枪向每个样品管中分别加入去离子水25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，进行振荡萃取；C、萃取完后把内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。

技术领域

本发明属于烟草化学研究领域，具体涉及一种适合烟草基因编辑素材中总植物碱含量检测的高通量分析方法。

背景技术

随着烟草行业“烟草基因组计划重大专项基于基因组编辑技术的工厂化育种方案”的推进，以所有基因编辑素材为对象，通过化学成分分析对素材进行筛选，并通过烟叶的配伍性测试和卷烟配方验证，确定工业可用性强的品种，成为了烟草行业迫切需求的关键技术内容。

烟草总植物碱是指烟草中所有的生物碱，烟草生物碱以烟碱最重要，它占烟草生物碱总量的95％以上，其次是去甲基烟碱(降烟碱)、新烟碱等，故在测定烟草总植物碱的含量时，常以烟碱计。过高的烟碱含量会严重影响烟叶品质，降低烟叶在卷烟配方中的可用性。通过检测烟碱含量与烟叶厚度、种植密度的关系，可以在生产中降低烟叶烟碱含量，提高烟叶的可用性。烟碱含量在医学上也是重要指标，可缓解和治疗多种疾病，如帕金森、阿尔兹海默病、神经衰弱、记忆衰退等。

目前烟草中总植物碱的检测常用连续流动分析法。连续流动分析技术将标准工作液、试样、试剂按比例泵入化学分析器中，并同时定时送入气体，使管路中形成连续流体分隔系统，使参与反应的物质在连续流动的过程中充分混合，然后经过一系列反应如混合、加热、过滤等，最后通过检测器检测得到相应的峰值电信号，再通过标准曲线自动计算得到相应的浓度。连续流动分析技术具有检测速度快、样品和试剂用量少等优点，在国内外烟草行业得到了广泛应用。

在目前烟草常规化学成分分析的标准方法(YC/T 468-2013)中，总植物碱的测定采用水萃取样品，然后再用连续流动分析仪分光光度检测器于460nm波长处测定。在样品前处理过程中，需将样品称取至磨口三角瓶中，加入萃取剂振荡萃取，用定性滤纸过滤，过滤后的溶液转移至连续流动分析仪的进样管中，然后才能进行后续测定。在过滤的过程中，需将三角瓶中固体样品残渣与提取液的混合物倾倒于瓶口放置有定性滤纸折叠的漏斗中，将滤后的提取液收集在收集瓶中。样品前处理过程中需几次转移样品，不够简便，影响检测的工作效率；而且转移过程中可能会因引入杂质和提取液的不小心泼洒等影响到检测结果的可靠性。

基因编辑工厂化育种至少会产生数万个编辑素材，目前总植物碱样品分析的日样品处理量只有60个左右，完成数万个素材的常规化学成分分析需要很长周期，分析结果的滞后将会影响到整个工厂化育种的进度，因此在基因编辑育种过程中对准确可靠的高通量快速分析方法的需求非常迫切。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因编辑素材总植物碱测定的快速样品前处理方法，包括以下步骤：

A、准确称取0.25g含有总植物碱的样品置于25mL样品管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样盘，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪进样盘上，直至将该进样盘中的100个样品管位全部放满样品管；

B、用25mL的移液枪向每个样品管中分别加入去离子水25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，按标准方法选定的振荡萃取条件进行振荡萃取；