[发明专利]从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用

说明书

本发明涉及一种从微量组织中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用。所述方法包括：向组织样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。该方法操作简单，可提升样本中蛋白质的提取量，增加蛋白质的鉴定和定量。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学领域，具体涉及一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、对提取的肽段溶液进行定量检测的方法以及用于从微量组织中提取和消化蛋白质的试剂盒。

背景技术

激光捕获显微切割技术(LCM)是一种可以在显微镜直视下快速准确的获取所需的单一细胞亚群甚至单个细胞的技术。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分，且研究的目标细胞(如癌前病变细胞或侵袭性的癌细胞)往往被其它组织成分所环绕，原始组织的异质性极大影响了实验结果的准确性和可靠性。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。激光捕获显微切割技术(LCM)正好可以解决组织中细胞异质性的问题。

发明内容

在从微量样品中提取蛋白的过程中，蛋白提取过程需要不断的进行转管操作，这样就会对本来不多的样品造成巨大的损失，从而影响相应的实验结果。此外，在提取蛋白后不进行进一步分离的条件下，鉴定和定量的蛋白质种类比较少，而如果进行进一步分离则对精确定量有影响。本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法和试剂盒，一方面使得样品提取操作简单，无需转管，从而减少样本损失，另一方面可以提升微量样本中蛋白质的提取量，增强蛋白质的鉴定效率和定量，该方法可以适用于低至0.1μg的蛋白样本的提取和消化，例如可以适用于从少量的细胞样本中提取多肽，也适用于从切片组织中提取多肽，用于蛋白质组学的研究。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，包括：

向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；

将裂解后的组织样品进行超声处理；

向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；

向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；

向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。

根据本发明的实施例，利用含有可挥发的碱性试剂的裂解液，在对得到的肽段溶液进行质谱测定时，不需要对裂解液中的碱性试剂进行专门的去除操作即可用于质谱上机的鉴定，然后采用超声处理，可以有效的将组织破碎，将蛋白提取出来，然后加入胰蛋白酶进行酶解，由此可以提高组织样品中蛋白质和多肽的提取量，而且采用本发明的方法，所有的操作可以只在一个管子中进行，避免了转管带来的样品损失。通过该方法得到的肽段溶液可以直接适用于质谱上机检测，不需要对得到的肽段溶液再进行其他处理，从而可以节约样品，尤其适用于样本量很少的蛋白质和多肽的提取。其中，裂解液中含有的可发挥的碱性试剂可以为可挥发的盐或者可挥发的弱碱溶液，例如可以为乙酸铵、氨水或者碳酸氢铵等。

根据本发明的实施例，本发明所述从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，可以进一步包括如下附加技术特征：