[发明专利]一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法

说明书

本发明公开了一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法。所述方法包括通过向绿豆细胞内引入dsRNA对cha基因的目标区域进行干扰；向绿豆细胞内引入dsRNA的方法包括：针对RNA干扰的目标区域设计DNA片段，所述的DNA片段为5’‑目标序列‑连接序列‑目标序列的反向互补序列‑3’，其中连接序列不与目标序列互补；将所述的干扰片段连入植物表达载体，获得RNAi载体；将所述的RNAi载体转化绿豆植株。本发明利用RNAi技术对cha基因进行RNA干扰，使该基因的表达水平下调，可以选育得到缺失龙骨瓣且柱头、花药外露的绿豆新种质，有利于花粉的互相传播及杂交制种，为绿豆的杂交种利用打下基础。

技术领域

本发明涉及分子育种、基因工程有分子生物学领域，尤其涉及一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法。

背景技术

绿豆(Vigna radiate L.)是我国主要食用豆类作物之一，其含有丰富的维生素和矿物质、膳食纤维、蛋白，深得消费者喜爱。但是，绿豆品种均为产量较低的常规品种，产量一般只是1000至1500公斤/公倾。由于单产低，难于与其它大田作物竞争，面积不断萎缩。因此如何大幅度提高绿豆产量是广大绿豆育种家所必须面临和解决的迫切问题。

杂交优势的利用是提高作物产量的途径之一。杂种优势是生物界的一种普遍现象，一般是指杂种在生长势、生活力、抗逆性、繁殖力、适应性、产量、品质等方面优于其亲本的现象。目前已经有多种作物的杂交种被利用于生产。在天然自交受粉的作物之中，水稻的杂种优势的利用是最好的例子，杂交稻一般比常规稻增产10-20％。中国在1973年就建立起“三系配套”的水稻育种系统，近年来杂交水稻的种植面积一直都超过水稻种植总面积的50％(Cheng et al.,2007)。Chen等(2003)发现利用绿豆品种KPS1与Korea7等不同组合配制的杂交组合后代在产量上最高可得到40％以上的超亲优势。

但是绿豆是严格的闭花授精植物，其花器官为蝶形花，花药和柱头被包裹在龙骨瓣内，阻碍植株之间进行花粉交流，其天然自交率大概只有1.1％(Sangsiri et al.,2007)，这是绿豆杂交种制种过程中的一大障碍。因此，获得能够开花传粉的绿豆植株对绿豆的杂交制种至关重要。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明的目的之一是提供一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，可成功获得开花传粉绿豆；本发明的目的之二是提供相关的DNA片段及其重组载体、表达盒或宿主菌以及dsRNA。

技术方案：本发明所述的基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，包括对绿豆的cha基因进行RNA干扰，其中RNA干扰的目标区域为cha基因的CDS序列。

进一步的,RNA干扰的目标区域为cha基因的第三外显子。

所述RNA干扰时，通过向绿豆细胞内引入dsRNA对所述的目标区域进行干扰。

所述dsRNA具有相互补的正义链和反义链，其中正义链的序列为SEQ ID NO.3所示。

所述向绿豆细胞内引入dsRNA的方法包括：

(1)针对RNA干扰的目标区域设计DNA片段，所述的DNA片段为

5’-目标序列-连接序列-目标序列的反向互补序列-3’，其中连接序列不与目标序列互补；

(2)将所述的干扰片段连入植物表达载体，获得RNAi载体；

(3)将所述的RNAi载体转化绿豆植株。

步骤(1)中，DNA片段中，所述目标序列的序列如SEQ ID NO.2所示。所述连接序列不与目标序列互补是指连接序列与目标序列无法形成互补的双链结构。通过连接序列，DNA片段能够在细胞内形成颈环结构。所述的连接序列可为PDK intron。