[发明专利]一种用于高密度发酵的枯草芽孢杆菌

说明书

本发明公开了一种用于高密度发酵的枯草芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，敲除枯草芽孢杆菌WSH11和CICIM B0629的ppsE、sfp这两个基因，得到突变菌株WSH13和CICIM2。制备枯草芽孢杆菌WSH11、WSH13、CICIM和CICIM24种菌感受态，转化环糊精葡萄糖基转移酶表达质粒，得到4种环糊精葡萄糖基转移酶重组菌，经过摇瓶和3‑L罐上罐测定酶活和发酵过程中产泡沫的情况，结果表明以CICIM2为宿主时环糊精葡萄糖基转移酶的表达稍有下降，且发酵过程中，泡沫产量减少不显著。以WSH13为宿主时环糊精葡萄糖基转移酶的表达较好，且发酵过程中，泡沫产量明显减少。

技术领域

本发明涉及一种用于高密度发酵的枯草芽孢杆菌，属于基因工程领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌Bacillus substilis是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，具备无致病性，环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，而且还具有良好的发酵基础，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力，目前广泛用于生产各种工业用酶。枯草芽孢杆菌遗传背景清晰，实验模式菌株B.subtilis 168已完成全基因组测序，并根据发酵工艺需求改造成多种突变体，例如工业上使用的菌株B.subtilis WB600和B.subtilis WB800。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSH11是本实验室以枯草芽孢杆菌WS5为出发菌株，敲除nprB、bpr、mpr、vpr、epr和wprA基因，实现高密度发酵的菌株，减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生。但泡沫产量仍需进一步降低，减少发酵过程中消泡剂的添加量。枯草芽孢杆菌在生长过程中分泌脂肽类生物表面活性剂，结构上含有亲水的肽键和疏水的脂肪烃链两部分，在液体表面聚集会产生泡沫，主要有表面活性素类(surfactin)，伊枯草素类(iturin)，芬芥素(fengicin)，大侧柏素(plipastain)，地衣素(lichenysin)，帕米拉素(pumilacidin)，多粘菌素(polymixin)等。枯草芽孢杆菌WS5含有表面活性素类、草素类、芬芥素、大侧柏素、地衣素的表达基因。在发酵过程中会产生大量泡沫，不利于发酵过程调控，影响菌体生长以及发酵产酶。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一株适用于高密度培养的枯草芽孢杆菌WSH13，以枯草芽孢杆菌WSH11为出发菌株，敲除ppsE和sfp两个基因，减少发酵过程中泡沫产量。

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌，所述重组菌敲除了侧柏素合成酶ppsE和4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶sfp两个基因。

在本发明的一种实施方式中，所述ppsE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述sfp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌WS5、枯草芽孢杆菌WSH11或枯草芽孢杆菌CICIM B0629为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌WSH11为宿主菌，所述枯草芽孢杆菌WSH11是以枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016536为出发菌，敲除nprB、bpr、mpr、vpr、epr和wprA基因得到。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016536在CN106754466A的专利申请文件中公开。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌CICIM B0629保存江南大学工业微生物资源和信息中心，保藏编号为CICIM B0629，保藏地址为中国无锡江南大学。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以质粒pHY300为载体进行敲除。