[发明专利]人双调蛋白克隆至人工改造的表达载体pGEX-4T-1及其原核可溶性表达的研究

说明书

本发明公开了将人双调蛋白克隆至人工改造的表达载体pGEX‑4T‑1及其原核可溶性表达的研究成果，解决了真核外源基因在原核表达系统内易形成包涵体的问题。通过切除原核表达载体pGEX‑4T‑1上GST（谷胱甘肽转移酶）标签，添加促溶标签SUMO，构建重组质粒pGEX‑SUMO；然后将人双调蛋白基因AREG克隆至重组质粒pGEX‑SUMO上；再对目标蛋白可溶性表达条件进行优化，分离纯化出重组天然蛋白SUMO‑AREG；最后对SUMO‑AREG酶切去除标签，进一步纯化获得重组蛋白AREG。本发明能生产出具有天然结构的重组蛋白AREG，对后期人双调蛋白的生理功能的研究提供一个好的基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学与蛋白质组学领域，具体的是说人双调蛋白克隆至人工改造的表达载体pGEX-4T-1及其可溶性表达的研究。

背景技术

人类AREG基因位于4号染色体q13~q21区域，AREG基因转录为包含6个外显子的mRNA，这种mRNA可编码一种由252个氨基酸组成的跨膜双调蛋白前体。这种双调蛋白前体在蛋白酶作用下可被水解释放出可溶的双调蛋白。双调蛋白在许多正常组织和器官中都有表达，包括泌尿生殖系统、循环系统、呼吸系统及内分泌系统等。双调蛋白参与人体内一系列生理过程，如女性生殖系统发育、精子发生、胚胎着床，肺、肾和前列腺的形态发生，神经元发育、骨组织发育和免疫功能的维持等。AREG也与一系列肿瘤的发生发展相关，在肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等癌组织中，AREG表达量显著增高，而且它还参与到肿瘤细胞的增殖、转移及侵蚀过程。

泛素（SUMO）是一种广泛存在于真核生物细胞中的蛋白，由101个氨基酸组成。SUMO作为融合蛋白表达标签主要有两个特征，首先其作为一种融合标签，能够提高蛋白的产量且能够促进蛋白的可溶性表达；其次融合蛋白中的SUMO能被高度特异性的去泛素化酶识别并切除，不影响目的蛋白的生物活性及其后续生物学功能的研究。

原核表达载体pGEX-4T-1上自带的GST标签经切除后，并将SUMO基因连接到此载体上，构建新的原核表达载体pGEX-4T-1-SUMO。重新改造的载体较原载体有两大优势，一是能明显提高目标蛋白的表达量；二是能提高目标蛋白的可溶性表达。促溶标签SUMO解决了人AREG在原核表达系统内不易形成可溶性的蛋白的问题，这对人双调蛋白生物学功能研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是为了克服原核表达系统易形成包涵体沉淀的问题，而提供的一种利用促溶标签SUMO来增加目标蛋白的可溶性表达的方法，有效地提高了人双调蛋白的可溶性。

技术方案包括以下步骤：

（1）利用HeLa细胞cDNA文库为模板，通过PCR扩增得到人SUMO基因，然后将pGEX-4T-1和SUMO基因经MscI、BamHl双酶切，通过连接转化构建pGEX-4T-1-SUMO。

（2）人工合成人双调蛋白基因AREG，AREG和pGEX-4T-1-SUMO经BamHl和Xhol 双酶切后连接，构建重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG。

（3）用CaCl2法将重组质粒转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)中，构建工程菌。

（4）构建好的工程菌用IPTG诱导表达，并从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白可溶性表达进行优化。

（5）用Ni-NTA亲和层析纯化SUMO-AREG，CoolCutter™ SUMO蛋白酶切除SUMO标签，进一步用Ni-NTA亲和层析纯化酶切产物。

所述步骤（1）中，以HeLa细胞cDNA文库为模板，PCR扩增得到人SUMO基因，设计引物时添加MscI和BamHl两个酶切位点。

所述步骤（1）中，PCR扩增SUMO基因所用到的引物，在合成过程中已添加6个组氨酸（6His），目的是便于后续融合蛋白的纯化，纯化方法是Ni-NTA亲和层析纯化。