[发明专利]高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法

说明书

一种高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法，系以十二种试剂参与基因芯片反应流程，至少包括RNA萃取、生物素标定、杂合反应、以及讯号侦测步骤。本发明不包含PCR核酸放大技术，并将RNA反转录反应与生物素标定整合为一个步骤，再透过创新配方与重复反应达到相对应的功效。其中生物素标定试剂配方的创新处，在于包含反转录反应的试剂，因此无须分开两个步骤进行。而该重复反应乃指重复进行反转录级生物素标定，可加强杂合反应后的讯号。藉此，透过本发明提出的高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法，可于临床检验检查时，不需进行放大，透过基因芯片就可以检测检体中所的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。

技术领域

本发明有关于一种高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法，尤指涉及一种不包含PCR核酸放大技术，并将RNA反转录反应与生物素标定整合为一个步骤，再透过创新配方与重复反应达到相对应的高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法。

背景技术

对基因过渡表现（Overexpression）的分析已经导致疾病诊断的基本进步与临床进展。而研究基因过渡表现的技术包含有北方墨点法（Northern Blot）、反转录聚合酶链锁反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）及实时定量聚合酶链锁反应（Real-Time PCR）。其中北方墨点法由于操作步骤十分繁琐，所需检体量又过多，因此仅限于研究操作上，无法实际应用于临床诊断。至于反转录聚合酶链锁反应RT-PCR及实时定量聚合酶链锁反应Real-Time PCR由于操作步骤简便，因此在单一基因检测的应用上，使用相当广泛，例如肝炎病毒的检测及感染症病原菌的鉴定。然而，虽然PCR（聚合酶链锁反应序列）的创作是作为整体最伟大的实验，但多数PCR技术仍保有特定的共同问题，其主要问题包含有：首先为污染，过渡灵敏侦察的伪阳性，例如雾式的DNA或先前的样品残余；其次，为RT-PCR仅被认为半定量，因为当比较不同的样品时，难以控制序列放大效率；再者，由于所需引子（Primer）间黏合（Annearling）的干扰，无论RT-PCR或Real-Time PCR都仅广泛应用于单一基因标的检测，当检测标的为基因群时，则PCR相关的技术则有操作耗时、费事及高成本等缺点。

随着近几年来生物科技的快速发展，生物芯片于临床医学诊断或药效评估上的应用逐渐被重视，本发明的先前研究已开发并且评估一尼龙膜芯片（Membrane Array）方法，能使用于癌症诊断，在血液检体（Peripheral Blood）中同时查出一多种mRNA标记引物的表现。其分子标志的表现由RT-PCR与尼龙膜芯片评估，数据从RT-PCR与尼龙膜芯片取得，且受制于线性回归分析，显示在这两个方法结果之间的高度相互关系（r=0.979，P<0.0001）。另外，以相关衍生技术的加权化学冷光型基因芯片（Weighted Chemiluminescent MembraneArray, WCHMA），用于肺癌（Lung Cancer）患者的血液检体分析标的治疗药物（TargetTherapeutic Drug）的作用标的K-ras的异常情形，也已被接受刊登于肺癌期刊中。

虽然尼龙膜芯片于分子诊断及药效评估上的应用已有许多报告提出，然而，由于原始尼龙膜芯片所使用判读方法上，对于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下，造成检测特异性在达到一定程度之后便不易提升。对此，本发明人研究开发了一基因群检测结构，虽可大量并快速进行生物检体检测分析，但其检测过程需要先行放大，并无法达到直接从血液检测透过基因芯片就能侦测血液里的基因表现，导致在芯片检测灵敏度及方便性等方面的要求仍嫌不足。于是，本发明再研究开发一酵素型基因芯片侦测试剂组结构，虽然不需进行放大，即可达到直接从血液检测透过基因芯片就能侦测血液里的基因表现，但其包含RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应、以及讯号侦测等繁复的操作步骤，且其杂交反应仅一阶段温控，所耗反应时间长（需至少6.4小时以上）；因此，整体而言，该技术造成侦测所需时间冗长及耗费大量溶剂清洗（六阶段清洗步骤），导致成本增加且降低效率与效能之余，其产出讯号时背景值亦较高，更有讯号易失真等问题。故，一般已用者无法符合使用者于实际使用时的所需。