[发明专利]一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法

权利要求书

1.一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，该方法包括如下步骤：

构建细胞膜色谱—CMC：

1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2，RPMC，MPMC，MrgX2-HEK293，MrgX3-HEK293五种，将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于2-6℃，离心，得沉淀为细胞；加入生理盐水清洗，重复1-3次；细胞用2-6℃冰浴超声，并细胞破碎4-8次；然后悬浮液于2-6℃，离心；吸取上清液；再次于2-6℃，离心，吸弃上清液，得到细胞沉淀；细胞沉淀加入生理盐水，得到细胞膜溶液；

1.2)取硅胶，活化；活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫；再于冰上，抽真空冷却；在抽真空状态下，将1.1)制备的细胞膜溶液与活化硅胶混合至均匀；2-6℃条件下磁力震荡，吸出磁子后静置过夜；然后在2-6℃下，离心，弃上清液；生理盐水清洗沉淀，重复1-3次；得到硅胶细胞膜混悬液；

细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液，然后用三蒸水补满色谱柱；以超纯水为流动相，将压力稳定到6～12Mpa后，色谱柱下端有液体滴落时开始计时，计时2-10min，即装填好细胞膜固定相。

构建CMC-HPLC/MS系统：

将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中，装入液相色谱仪中，以纯水为流动相，构成CMC系统；样品进入CMC系统等度洗脱，样品中存在的致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将出峰，其余组分则被洗脱；致敏组分在细胞膜上有保留，根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液8-15次后将所得的溶液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析，根据其分子离子峰判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。

2.如权利要求1所述的筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，该方法包括如下步骤：

构建细胞膜色谱—CMC：

1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2，RPMC，MPMC，MrgX2-HEK293，MrgX3-HEK293五种，将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃，1200rmp离心5min，得沉淀为细胞；加入生理盐水清洗，重复2次；细胞用4℃冰浴超声30min，并用细胞破碎仪破碎5～6次；然后悬浮液于4℃，1200rmp离心10min；吸取上清液；再次于4℃，12000rmp离心30min，吸弃上清液，得到细胞沉淀；细胞沉淀加入5ml生理盐水，得到细胞膜溶液；

1.2)取硅胶0.05g，105℃活化30min；活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫；再于冰上，抽真空冷却；在抽真空状态下，将1.1)制备的细胞膜溶液5ml与活化硅胶混合至均匀；4℃条件下磁力震荡30min，吸出磁子后静置过夜；然后在4℃下，3000rmp离心5min，弃上清液；生理盐水清洗沉淀，重复2次；得到硅胶细胞膜混悬液；

细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液，然后用三蒸水补满色谱柱；以超纯水为流动相，流速为2.0mL/min，将压力稳定到8～10Mpa后，色谱柱下端有液体滴落时开始计时，计时5min，即装填好细胞膜固定相。

构建CMC-HPLC/MS系统：

将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中，装入液相色谱仪中，以纯水为流动相，构成CMC系统；样品以0.1～0.2ml/min流速进入CMC系统等度洗脱，样品中存在的致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将在20～50min出峰，其余组分则被洗脱；致敏组分若在细胞膜上有保留，根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液8-15次后将所得的溶液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析，根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。