[发明专利]一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法

说明书

本发明公开了一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，本发明首先对动物组织进行前处理，剪碎后过滤，利用细胞分离液进行单个核细胞分离，保证收集的单个核细胞细胞活性较高，加入DnaseI消化死亡细胞的DNA，并利用细胞洗涤液进行洗涤，有效降低背景干扰和成本，再进行Tn5转座酶切反应与纯化，qPCR确定建库所需循环数，最后对得到的单个文库进行等摩尔混合，采用优化过的两轮磁珠比例分选得到高质量的上机文库，为广大科研人员研究动物组织淋巴细胞易接近转座酶核染色质高通量测序提供重要的实验方法参考。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法。

背景技术

淋巴细胞在免疫反应过程中起着十分重要的作用，它的数目和功能状态反应了机体所处的免疫状态，与一些先天或后天的免疫缺陷性疾病、传染性疾病以及恶性肿瘤等免疫功能障碍等疾病有密切关联。因此，研究淋巴细胞对各种疾病的诊断、预防及治疗有着极为重要的意义。

ATAC-seq是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)的一种创新表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。

真核细胞将基因组DNA与组蛋白通过不同层次的折叠组装成染色质，这些精密组装信息在基因转录调控中起决定性作用。染色质区域的可接近性是特异性反式作用因子和顺式调控元件相互作用的前提，基因表达的异常或者染色质调控因子的改变都将对细胞的命运产生深远的影响，进而导致各种疾病的发生与发展。目前该技术已被广泛应用于转录调控序列的鉴定。ATAC-seq技术可运用于所有真核细胞重编程的研究，在医学领域是重大疾病发病机制、药物作用机制、新药研发和生物标志物功能等研究的新一代有利工具。

染色质结构在促进基因表达控制方面起着关键作用。转录因子结合的顺式元件通常与染色质区域的可接近性相关。因此，在动物基因组中识别这些可接近性区域，将有利于提高对转录因子结合、染色质状态和基因表达调控三者之间关系的理解。ATAC-seq现在通常被用于系统地鉴定动物基因组中的顺式调控区域和DNA足迹，目前，这种方法应用于培养的单细胞悬液中已逐渐普及开来，但直接利用组织进行淋巴细胞检测实验仍未见报道，一是大大节约了时间周期，无需先将组织消化进行培养；二是为一些科研单位没有条件进行细胞培养，时间紧迫想直接利用收集的动物组织进行ATAC-seq研究提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，大大的节约了时间周期和解决了一些硬件条件限制，采用优化过的实验条件，有效降低了背景干扰，通过两轮磁珠分选，保留最佳上机测序文库大小，从而得到高质量上机数据，为组织淋巴细胞易接近转座酶核染色质的研究提供重要的实验方法参考。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，包括以下步骤：

S1：动物组织经剪碎过滤处理后，得到单细胞悬浮液A；

S2：对单细胞悬浮液A进行单个核细胞分离，得到单个核细胞液B；

S3：对单个核细胞液B进行细胞裂解转座反应与纯化，得到转座产物C；

S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；

S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；

S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。