[发明专利]RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌引物及其方法和应用

权利要求书

1.一种实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-AACGCGTATTTGTGTCGAACATC-3＇，如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇-AAAATTCCACCAACCACCCAAAC-3＇，如SEQ ID NO.2所示；利用所述特异性引物进行实时荧光RT-PCR检测比进行PCR检测的灵敏度至少提高100倍。

2.一种包含权利要求1所述特异性引物的实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的试剂盒。

3.一种实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将提取的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea标准品的DNA进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的DNA，以其为模板，以SEQ ID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子分别作为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为纵坐标，以扩增得到的Ct值作为横坐标，制作标准曲线；

(2)从猕猴桃果品中提取DNA，并将其稀释至步骤(1)所得标准曲线范围内；以SEQ IDNO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子引物进行实时荧光定量PCR扩增，得Ct值，然后根据步骤(1)所得标准曲线计算出目标片段的拷贝数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，提取DNA的方法为CTAB法。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CTAB法的步骤为：

1)取适量的猕猴桃果品放入1.5ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；

2)加入550μL 65℃预热的CTAB提取液，剧烈振荡后，放于65℃恒温箱中1h，其间间隔10min振荡混匀一次；

3)加入550μL氯仿异戊醇，剧烈震荡并充分混匀，静置10min，于13000r/min转速下离心5min；

4)取上清，加入600μL冰乙醇，于13000r/min转速下离心5min，倒掉上清，用75％乙醇冲洗沉淀；重复该步骤至少1次；

5)于7500r/min转速下空离心3min，用移液器吸去底部多余的液体，放于室温自然干燥；

6)干燥后，加入适量的灭菌ddH₂O充分溶解，然后保存于-20℃备用。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述标准曲线为：y＝-0.096x+30.77，R²＝0.905。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进行实时荧光定量PCR扩增时，采用的荧光定量PCR体系为SYBR Green Real time PCR Master Mix Plus，具体为：Solution 5μL、10mM的正向引物0.25μL、10mM的下游引物0.25μL、cDNA 2.5μL、ddH₂O、2μL。

8.根据权利要求3或7所述的方法，其特征在于，进行实时荧光定量PCR扩增时，采用的程序为：

1)95℃60s；

2)95℃15s；

3)60℃60s；

循环2)～3)39次。

9.权利要求3～8任一项所述方法在检测由Botryosphaeria dothidea引起的猕猴桃软腐病上的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括对猕猴桃种苗检疫、土壤病原菌检测、猕猴桃软腐病早期病害诊断以及Botryosphaeria dothidea的检测和鉴定。