[发明专利]一组检测啮齿柠檬酸杆菌的引物及其试剂盒

说明书

本发明涉及一组检测啮齿柠檬酸杆菌的引物及其试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明提供的用于检测啮齿柠檬酸杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物对；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本发明提供的特异性引物，特异性好，灵敏度高，能够实现啮齿柠檬酸杆菌的快速检测。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一组检测啮齿柠檬酸杆菌的引物及其试剂盒。

背景技术

啮齿柠檬酸杆菌(Citrobacterrodentium，C.rodentium)为肠杆菌科柠檬酸杆菌属成员之一，在生物学特性上与致病性大肠杆菌相似，是目前所知唯一与人类肠出血性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌具有相同Lee毒力岛的鼠类自然病原。该菌为条件性致病菌，主要通过粪-口传播，病程短，一般持续4周左右，可引起小鼠传染性结肠增生，动物表现出被毛粗乱、体重减轻、发育迟缓、腹泻、结肠炎甚至直肠脱垂等症状。成年鼠一般不出现临床症状，未断奶或刚断奶仔鼠较成年鼠易感。

经典的C.rodentium检测方法为分离培养，可在麦康凯培养基上生长，革兰阴性短杆菌，无芽孢，无动力，生化反应与沙门菌非常相似，极易混淆。由于动物肠道内含有其他种类的柠檬酸杆菌属成员，细菌自动鉴定系统资料库中很少覆盖全部的柠檬酸杆菌属成员信息，分离培养结合生化鉴定很容易造成误判，需结合更进一步的分子分型才能进行鉴定。因此培养法对于该菌的监测效果不太理想。常规分子生物学方法如PCR，因其具备快速、特异、灵敏等方面的优势，已被广泛应用，但检测过程需要昂贵的扩增仪等设备支持，且易发生污染导致假阳性等问题，某种程度上限制了该方法在一线现场的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一组检测啮齿柠檬酸杆菌的引物及其试剂盒。本发明提供的特异性引物，特异性好，灵敏度高，能够实现啮齿柠檬酸杆菌的快速检测。

本发明提供了一组用于检测啮齿柠檬酸杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物对；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括：2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光染料和权利要求1所述引物。

优选的是，所述外引物的浓度分别为5μmol/L。

优选的是，所述内引物的浓度分别为40μmol/L。

优选的是，所述环引物的浓度分别为20μmol/L。

优选的是，每25μL反应体系的试剂盒包括2×反应缓冲液12.5μL，权利要求1所述引物各1μL；BstDNA聚合酶1μL，荧光染料1μL。

本发明提供了一组用于检测啮齿柠檬酸杆菌的引物。本发明提供的引物利用具有链置换活性的DNA聚合酶和引物特异性地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下保温几十分钟，即可完成核酸的扩增。本发明所述特异性引物特异性好，灵敏度高，对后续检测过程使用的仪器设备要求低，能够实现啮齿柠檬酸杆菌的快速检测，适宜推广应用。试验结果表明，本发明所述引物用于检测啮齿柠檬酸杆菌时最低检测线是2.32pg。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的扩增温度优化结果图；

图2为本发明实施例3提供的特异性试验LAMP扩增图；

图3为本发明实施例3提供的特异性试验可视化检测结果图；

图4为本发明实施例3提供的特异性试验电泳检测结果图；