[发明专利]一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法

权利要求书

1.一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制染料母液

将染料A配制成100-200μM的DMSO的母液，将染料B配制成1-2mM的DMSO的母液；所述染料A为A-1、A-2或A-3，染料B为B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6或B-7；

所述染料A和染料B的结构如下：

染料A：

染料B：

(2)标准曲线的制备

在10-50μg/μL的浓度范围内，制备5-15份不同浓度的一系列外泌体标准液；向一系列外泌体标准液中加入染料A的母液和染料B的母液，使得染料A的浓度为100-200nM，染料B的浓度为1-2μM；混匀室温下反应后，在相同波长激发下，测定染料A以及染料B的荧光光谱，以染料B与染料A最大发射处的荧光强度的比率值作为纵坐标，标准外泌体溶液的浓度作为横坐标，制作标准曲线；

(3)待测外泌体样品的浓度

向待测外泌体的样品加入染料A的母液和染料B的母液，使得染料A的浓度为100-200nM，染料B的浓度为1-2μM；混匀室温下反应后，测定染料A以及染料B的荧光光谱，得到染料B与染料A最大发射处的荧光强度的比率值，带入标准曲线方程，得到待测外泌体样品的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)荧光染料母液的配制

染料A母液的配制：配制染料A-1的DMSO母液100μM，

染料B母液的配制：配制染料B-1的DMSO母液1mM，

(2)标准曲线的制备

分别取外泌体标准液0、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250μL，依次配成浓度为0、4.52、9.04、13.56、18.07、22.59、27.10、31.62、36.14、40.66、45.18μg/μL外泌体标准液；分别加入染料A-1母液，使染料A-1溶液的浓度为100nM；加入染料B-1母液，使染料B-1溶液的浓度为1μM；震荡均匀后室温下反应10min，测定染料A-1和染料B-1的荧光光谱；染料B-1在615nm处的的荧光强度与染料A-1在584nm处的荧光强度的比率值作为纵坐标，外泌体标准液浓度作为横坐标制作标准曲线，得到标准曲线方程为：y＝0.0315x+0.4824，R²＝0.965,其中x为10-50μg/μL；

(3)外泌体样品的测定

取待测外泌体样品，依次加入染料A-1母液，使染料A-1溶液的浓度为100nM；加入染料B-1母液，使染料B-1溶液的浓度为1μM；震荡均匀后室温下反应10min,测定染料A-1和染料B-1的荧光光谱；计算出染料B-1在615nm处的的荧光强度与染料A-1在584nm处的荧光强度的比率值，根据荧比率值带入标准曲线得到待测外泌体样品的浓度。

3.根据权利要求1所述的一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其特征在于：该方法应用于细胞培养基、唾液、血清、尿液、乳液。