[发明专利]分泌抗水稻瘤矮病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗水稻瘤矮病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用原核表达的水稻瘤矮病毒(RGDV)CP重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗RGDV单抗的杂交瘤细胞株11B6，其保藏号为CGMCC No.14897。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达到10^‑8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链。该单抗与RGDV外壳蛋白有特异性反应。利用11B6单抗为核心建立检测RGDV的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法，这两种方法检测病叶的灵敏度分别达到1:327 680和1:20 480倍稀释(w/v,g/mL)。该杂交瘤细胞株及其单抗的获得和血清学检测方法的建立为该病毒病的检测、诊断及科学防控提供了物质和技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗水稻瘤矮病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

水稻瘤矮病是由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)引起的一种水稻病毒病害。自1979年在泰国发现后，水稻瘤矮病相继在马来西亚、日本、韩国等地发现。1981年在我国广东首次发现RGDV，目前水稻瘤矮病主要流行于我国的广东、广西、福建、海南等南方稻区，发病严重的田块甚至无法正常抽穗，颗粒无收。RGDV寄主植物除了水稻外，还包括小麦、大麦、燕麦、看麦娘、野生稻和玉米等禾本科作物，但其不侵染稗草。侵染RGDV水稻的典型症状包括：发病的植株矮缩，分蘖减少，新叶短而窄，叶色变深，叶背部和叶鞘有0.1-0.2mm大小的圆形白色瘤状突起，每叶有0-30个。RGDV由传播介体电光叶蝉和黑尾叶蝉以持久增殖型方式传播，叶蝉一旦获毒，即终身带毒并可经卵传播。RGDV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)，植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)。RGDV的病毒粒子属于二十面体，三重对称，球状，直径约为65-70nm。RGDV的基因组序列已经全部测定完毕，含有12条dsRNA组成，每条RNA片段均只编码一个蛋白，包括六个结构蛋白(P1、P2、P3、P5、P6和P8)和六个非结构蛋白(Pns4、Pns7、Pns9、Pns10、Pns11和Pns12)。

电光叶蝉和黑尾叶蝉在我国分布广泛、危害性大，且其作为传毒介体传播RGDV引起的水稻瘤矮病近年来在我国危害严重，造成水稻严重减产。而病毒的检测技术是该病毒病防控的关键。目前根据症状观察判断田间水稻瘤矮病毒的发生情况仍然是最主要的方法，但病毒侵染前期水稻没有任何症状，且多种病毒病造成的症状极为相似，另外，常有病毒复合侵染情况，因此依靠症状观察得到的结果缺乏准确性和科学性。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且有些不同病毒粒子的大小和形态有相似性，导致其仅作为一种辅助检测手段。基于PCR方法的分子检测技术虽然灵敏，但是不适于田间大规模样品的检测。血清学方法简单易操作、快速、灵敏、成本较低，且适用于田间样品的大规模检测，是目前理想的植物病毒的检测技术，但血清学方法必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。为此，本发明专利主要针对水稻瘤矮病毒单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗RGDV单抗杂交瘤细胞11B6，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法，从而为我国水稻瘤矮病毒的检测、诊断和科学防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗水稻瘤矮病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

分泌抗水稻瘤矮病毒单抗杂交瘤细胞11B6，它能分泌抗水稻瘤矮病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株11B6于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14897。

抗水稻瘤矮病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单抗与水稻瘤矮病毒47kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染RGDV水稻病叶的灵敏度分别达到1:327680和1:20 480倍稀释(w/v,g/mL)。