[发明专利]分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用提纯的水稻条纹花叶病毒(RSMV)为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗RSMV单抗的杂交瘤细胞株1D4，其保藏号为CGMCC No.14898。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达到10^‑10，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链。该单抗与RSMV的N蛋白有特异性反应。利用1D4单抗为核心建立检测RSMV的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法，这两种方法检测病叶的灵敏度分别达到1:2621440和1:40960倍稀释(w/v,g/mL)。该杂交瘤细胞株及其单抗的获得和血清学检测方法的建立为该病毒病的检测诊断及科学防控提供了物质和技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

水稻是我国乃至世界的重要粮食作物之一，而每年水稻病毒病对我国水稻产量造成了严重损失。2015年，在广东省罗定市太平镇田发现了一种新的水稻病毒病害，它的症状不同于已报道各种水稻病毒病，其为弹状病毒科细胞质弹状病毒属一个新种，命名为水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)。就目前所知，该病毒是迄今为止唯一自然侵染水稻的细胞质弹状病毒，也是首个经叶蝉传播的细胞质弹状病毒。RSMV感染植株轻度矮缩，叶片呈条纹花叶状，且有部分病叶表现扭曲，病株可抽穗，但抽穗不完全且籽粒空瘪。3叶期稻苗经电光叶蝉传毒接种后10天，新叶出现明显黄色条纹，随后叶片表现为花叶，叶尖向内侧卷曲。除了水稻外，在发病田或邻近田块的马唐草和鸭舌草中也检测到RSMV的存在。

RSMV病毒粒子呈杆状，有包膜，大部分成熟的毒粒子大小长300-360nm，宽45-55nm，其中一些断裂的病毒粒子最小长度为130nm；病毒粒子在细胞质中聚集并形成大量的晶格状，几乎充满整个细胞质空间，而细胞核内未观察到病毒粒子。此外，在晶格状附近有电子半透明颗粒及纤维状的病毒基质，这是病毒复制的场所。有些病毒粒子聚集在囊泡内。这些病毒粒子存在于叶肉细胞及维管束系统。在RSMV基因组的互补链上预测有7个ORFs，推测这7个ORFs的编码蛋白与多数弹状病毒的编码蛋白相似，ORF1预测编码病毒N蛋白；ORF2编码病毒的P蛋白；ORF3编码蛋白是一个碱性的膜蛋白，且该蛋白可能具有运动蛋白的功能；ORF4推测编码M蛋白；ORF5预测编码病毒G蛋白；ORF6推测编码一个辅助蛋白；ORF7预测编码病毒的L蛋白。RSMV的传播介体是电光叶蝉，其能以高效持久的方式传播RSMV。

目前，根据症状观察判断田间水稻条纹花叶病毒的发生情况仍然是最主要的方法，但病毒侵染前期水稻没有任何症状，且多种病毒病造成的症状极为相似，另外，常有病毒复合侵染情况，因此依靠症状观察得到的结果缺乏准确性和科学性。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且有些不同病毒粒子的大小和形态有相似性，导致其仅作为一种辅助检测手段。基于PCR方法的分子检测技术虽然灵敏，但是不适于大规模样品的检测。而血清学方法简单易操作、快速、灵敏、成本较低，且适用于田间样品的大规模检测，是目前理想的植物病毒的检测技术。但血清学方法必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。目前，国内外未见任何准对该病毒的抗体报道和专利申请。为此，本发明专利主要针对水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗RSMV单抗杂交瘤细胞1D4，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法，从而为我国水稻条纹花叶病毒的检测、诊断及病害的科学防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

分泌抗水稻条纹花叶病毒单抗杂交瘤细胞1D4，它能分泌抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株1D4于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14898。