[发明专利]一种VB12完全抗原的制备方法

权利要求书

1.一种维生素B12(VB12)完全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）30℃下将1g VB12溶于12ml二甲基亚砜（DMSO）溶液中后，随后将260mgN,N'-羰基二咪唑（CDI）加入到上述溶液中搅拌25分钟左右；

（2）将2.7mmol二胺烷烃类（1,6二氨基己烷或1,4二氨基丁烷）一次加入步骤（1）反应溶液中，室温下搅拌20-40h；

（3）将步骤（2）制备的溶液倒入30ml乙酸乙酯中，将瓶子竖立起来；

（4）步骤（3）混合溶液中上层清液缓慢倒出，余下残夜置于50ml丙酮中超声处理5分钟；

（5）步骤（4）中反应沉淀物经过过滤后，继续用丙酮洗若干次，通过柱层析纯化上诉产物得到VB12衍生物；

（6）通过质谱（MS）检测目标产物组分，确定产物纯度；

（7）步骤（5）中反应物加入载体蛋白(BSA，OVA或KLH)溶液再加入1mmol碳二亚胺（EDC）室温下搅拌4小时得反应混合物，VB12衍生物与载体蛋白摩尔比为20-50:1；

（8）步骤（7）中反应混合物经过pH7.2的PBS缓冲液透析除去未结合VB12衍生物即得到目标产物完全抗原。

2.根据权利要求1所述一种VB12完全抗原的制备方法，其特征在于，所述VB12本身不具有与载体蛋白直接反应的活性基团，必须添加改造VB12分子使其保留主体分子结构又具有能够与载体蛋白反应的活性基团-NH2等，含有游离羧基的蛋白大分子为牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙种球蛋白或者钥孔血蓝蛋白。

3.根据权利要求1所述维生素VB12完全抗原的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述1,6-己二胺为修饰VB12分子所添加的一条带有活性基团-NH2的间隔臂，可增强VB12与免疫细胞接触机会从而提高VB12的免疫原性。

4.根据权利要求1所述一种VB12完全抗原的制备方法，其特征在于，所述VB12质量为1g,二甲基亚砜12ml，载体蛋白与VB12摩尔比为1:20-50。