[发明专利]一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因

说明书

本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL‑mut及其编码基因。本发明所述的脂肪酶突变体TDL‑mut的突变位点为：突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C，进而获得一种热稳定性提高的1，3位置特异性脂肪酶突变体TDL‑mut。该突变体TDL‑mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL‑mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL‑mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，通过理性设计得到了热稳定性提高的1，3位置特异性脂肪酶突变体TDL-mut。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称三酰基甘油酰水解酶，属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶不仅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相体系中脂肪酶还可催化酸解、转酯和酯合成等反应。由于脂肪酶这种特殊的酶学特性使其广泛的应用于食品加工、饲料、洗涤、医药等领域。

随着不同工业领域的发展，对脂肪酶的要求也越来越高，如油脂加工和饲料工业领域许多工艺环节涉及到高温环境，热稳定性差的脂肪酶在上述工艺中易失活变性，因此开发热稳定性脂肪酶具有重要意义。本实验室前期克隆、表达了1，3位置特异性脂肪酶TDL，该酶具有很强的水解活性并且作用底物广泛，但是TDL在高温环境下容易变性失活，不利于其产业化应用。本发明通过理性设计获得了热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，为脂肪酶TDL的产业化应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的是通过对1，3位置特异性脂肪酶TDL进行分子改造，使改造后的脂肪酶具有更好的热稳定性，符合工业化应用的要求。

本发明的目的是提供热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其基因。

一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

原始脂肪酶TDL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。与脂肪酶TDL相比，突变体TDL-mut包含的突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。突变体TDL-mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL-mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

上述所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其最适反应pH均为8.0，最适反应温度为65℃。

一种获得上述热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法，其包括如下步骤：

1)脂肪酶TDL基因合成及克隆：将已公布的脂肪酶TDL基因(Genebank：AF123252)，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成得到合成基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pPICzαA上，得到重组载体pPICzαA-tdl；

2)理性定点突变：以pPICzαA-tdl为模板，进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果纯化回收PCR产物；使用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。