[发明专利]肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系

说明书

本发明公开了一种肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系，本体系涉及定量荧光PCR扩增技术和毛细管电泳检测技术。该体系可对NR‑21、NR‑24、NR‑27、MONO‑27、BAT‑25、BAT‑26这6个单核苷酸重复位点进行扩增的同时对Braf V600E、UGT1A1*6、UGT1A1*28位点进行分型。检测结果在判定MSI状态的基础上，可实现对Lynch综合征进行排查以及对伊立替康药物使用提供参考。本发明还提供据此而设计的检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及一种多重荧光PCR技术和毛细管电泳技术。同时检测6个单核苷酸重复微卫星位点以及Braf V600E、UGT1A1*6、UGT1A1*28位点的多态性，为结直肠癌等癌症患者的诊断及个性化用药提供参考，属于生物医学领域中的临床分子诊断检测技术。

背景技术

微卫星序列是指核心序列为1～6个碱基的短串联重复结构，这些重复序列分布在整个人类基因组中。在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象被称之为微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)。

微卫星不稳定是由错配修复(mismatch repair，MMR)基因缺陷造成。人类错配修复基因主要有MLH1、MSH2、PMS2、MSH6等。错配修复基因的功能是纠正DNA复制过程中出现的错误，确保复制过程的准确性。当错配修复基因突变、缺失或表观沉默而失去功能时，错配修复系统功能发生异常(MMR deficient，dMMR)，微卫星中重复核苷酸的数量可增多或减少，导致微卫星长度发生改变，由此产生MSI现象。

微卫星不稳定(MSI)现象在很多实体瘤中都存在。MSI发生率最高的肿瘤类型包括子宫内膜癌(22-33％)、胃癌(22％)、结直肠癌(10-15％)、甲状腺癌(63％)、皮脂癌(35-60％)，在肝癌、黑色素瘤卵巢癌、壶腹癌、宫颈癌、食管腺癌、软组织瘤、头颈癌、肾癌等中发生率也有一定比例(2-10％)。其中对结直肠癌MSI的研究开展最早、最为深入，而且很多MSI相关理论和应用已经得到广泛认可，被NCCN指南、ASCO指南等推荐应用于临床。

结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，病发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处。我国结直肠癌发病率占肿瘤发病率的第3位，仅次于肺癌和胃癌，且我国结直肠癌的中位发病年龄比欧美提前约10年，青年患者比欧美多见。

结直肠癌的发生分遗传性和非遗传性两类，遗传因素引起的结直肠癌包括家族性大肠腺瘤息肉病(Familial Adenomatous Polyposis，FAP)和遗传性非息肉病性结直肠癌(Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer，HNPCC，又称Lynch综合征)，非遗传性结直肠癌即散发性结直肠癌。研究发现FAP、Lynch综合征以及散发性结直肠癌的发生、发展的分子生物学途径不同。传统上按分子途径将结直肠癌分为两大类：染色体不稳定型(CIN)和微卫星不稳定型(MSI)。约80-85％的结直肠癌与染色体不稳定(CIN)有关，包括FAP和部分散发性结直肠癌。CIN结直肠癌是由于染色体局灶等位基因失衡、染色体扩增或异位等原因造成的。绝大多数CIN结直肠癌存在APC基因突变和染色体18q缺失，并有较高比例KRAS和p53基因突变，好发于左半结肠，组织学类型以高、中分化为主；约15-20％的结直肠癌存在微卫星不稳定(MSI)，包括Lynch综合征和部分散发性结直肠癌。MSI结直肠癌是由于DNA修复系统功能丧失导致的基因组水平突变增加，包括由碱基对替换、移码突变和短串联重复核苷酸序列的改变等，最终引发癌症。MSI结直肠癌多见于右半结肠，组织学类型以黏液腺癌和低分化腺癌为主。

MSI结直肠癌不仅在易发部位、组织形态上与CIN结直肠癌存在差异，而且在临床预后、治疗、遗传性筛查方案上也有所不同。因此对MSI结直肠癌的检测在临床上有重大意义。