[发明专利]一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂

权利要求书

1.用于制备造血干细胞的试剂盒，包括培养液Ⅱ、培养液Ⅲ、培养液Ⅳ和培养液Ⅴ；

所述培养液Ⅱ为由无胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4组成的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅱ中的体积百分含量为2%；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅱ中的浓度为1 mM；所述甘氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为 750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1320 ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1330 ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1470 ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1150 ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1050 ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅱ中的浓度为50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液Ⅱ中的浓度为5ng/ml；

所述培养液Ⅲ为由CHIR-99021和所述培养液Ⅱ组成；所述CHIR-99021在培养液Ⅲ中的浓度为2μM；

所述培养液Ⅳ为由添加了胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子组成的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅳ中的体积百分含量为2%；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅳ中的浓度为1mM；所述甘氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1320 ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1330 ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1470 ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1150 ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人血管内皮生成因子VEGF-165在培养液Ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液Ⅳ中的浓度为10ng/ml；

所述培养液Ⅴ为由SB431542和所述培养液Ⅳ组成；所述SB431542在所述培养液Ⅴ中的浓度为10μM。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括培养液Ⅵ；所述培养液Ⅵ为由细胞因子组合和干细胞培养液组成；所述细胞因子组合由干细胞因子、白细胞介素-3、白细胞介素-6、血小板生成素和FMS样酪氨酸激酶受体-3配体组成；干细胞因子在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；白细胞介素-3在培养液Ⅵ中的浓度为10ng/ml；白细胞介素-6在培养液Ⅵ中的浓度为10ng/ml；血小板生成素在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；FMS样酪氨酸激酶受体-3配体在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；所述干细胞培养液为StemSpan™ SFEM培养液。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括培养液Ⅰ；

所述培养液Ⅰ为由Y27632和干细胞培养液组成；所述Y27632在所述培养液Ⅰ中的浓度为5μM；所述干细胞培养液为TeSR-E8培养液。

4.一种制备造血干细胞的方法，包括如下步骤：

（1）将人多能干细胞接种于权利要求1中所述的培养液Ⅱ中，培养0.5-1.5天；

（2）将步骤（1）的细胞转移至权利要求1中所述的培养液Ⅲ中，培养1.5-2.5天；

（3）将步骤（2）的细胞转移至权利要求1中所述的培养液Ⅳ中，培养1.5-2.5天；

（4）将步骤（3）的细胞转移至权利要求1中所述的培养液Ⅴ中，培养2天-4天；

所述人多能干细胞为人胚胎干细胞系H1或诱导多能干细胞系CD34-iPSC。