[发明专利]针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法

说明书

本发明涉及肿瘤细胞治疗技术研发过程的基因工程载体构建与鉴定领域，提供了一种针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法，对第四代嵌合抗原受体CAR质粒阳性菌落进行PCR鉴定时，使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定。本发明的优点在于：对CAR质粒阳性菌落进行PCR鉴定时，由传统的“使用一对引物整体扩增测序鉴定”升级为“使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定”，这种改变将大大提高PCR扩增效率，同时也提高测序的准确性，预防由于检测片段过程造成检测假阴性结果的产生。

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞治疗技术研发过程的基因工程载体构建与鉴定领域，尤其涉及一种针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法。

背景技术

癌症的免疫疗法(Cancer Immunotherapy)是继手术、化疗、放疗和靶向疗法之后出现的一种新型治疗方法，它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症。免疫治疗经历了多年的不断发展，近几年取得了越来越多令人振奋的研究成果。而在众多免疫疗法中，最受瞩目且具前景的当属嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，它是免疫疗法与基因疗法相结合的创新疗法。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)，即CAR-T技术，是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scFv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(CD8、CD28)、胞内信号分子(CD3ξ)，共刺激因子(CD28、4-1BB、OX40)在体外进行基因重组，生成重组载体，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，也即CAR-T细胞，这些嵌合抗原受体修饰后的T细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合，而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径，从而克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，打破宿主的免疫耐受。所以，它是针对肿瘤治疗的一种优势明显的精准医疗的策略。

随着CAR-T细胞治疗技术的不断研发与升级，目前出现了第四代CAR-T细胞治疗技术，区别于第二/三代CAR-T技术，第四代CAR-T细胞表达细胞因子。表达的细胞因子包括IL12、IL2等重要的免疫细胞因子，能够改善肿瘤区域免疫抑制微环境，促进CAR-T细胞发挥作用。然而，在表达细胞因子CAR载体的构建过程中，对基因工程CAR载体进行鉴定与确认是至关重要的环节。重组了细胞因子导致整体目的基因分子量达到3000-4000bp，由于分子量过大，这给后续质粒转染阳性菌落的菌落PCR鉴定以及测序带来困难，极容易出现假阴性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种大大提高PCR扩增效率，同时也提高测序准确性的针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种针对第四代嵌合抗原受体CAR载体PCR鉴定的方法，对第四代嵌合抗原受体CAR质粒阳性菌落进行PCR鉴定时，使用两对引物单独进行扩增测序并鉴定。

作为本发明的优选方式之一，以慢病毒载体pCDH构建的第四代CAR质粒为对象，选用pCDH酶切位点前后两端序列以及CAR分子中CD3ζ中序列来设计两对引物，分别鉴定前段CAR分子以及后段细胞因子序列。

作为本发明的优选方式之一，所述两对引物具体如下：

引物1：

F1：accctgcttgctcaactctacgtc

R1：gtggctgtactgagaccctggtaaagg；

引物2：