[发明专利]一种NK细胞的无血清培养方法有效
| 申请号： | 201810124169.6 | 申请日： | 2018-02-07 |
| 公开（公告）号： | CN108300694B | 公开（公告）日： | 2020-10-20 |
| 发明（设计）人： | 李杰;刘振云;徐华栋;王维;程丰伟 | 申请（专利权）人： | 安徽古一生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/0783 | 分类号： | C12N5/0783 |
| 代理公司： | 合肥市浩智运专利代理事务所(普通合伙) 34124 | 代理人： | 王志兴 |
| 地址： | 238000 安徽省合肥*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 nk 细胞 血清 培养 方法 | ||
1.一种NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从25-35mL外周血分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至(1-3)×106细胞/mL，培养箱中静置培养过夜；
(2)NK细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的细胞培养瓶中，并补加无血清培养基至45-55mL，同时添加150-250ng/mL抗CD16抗体、450-550U/mL IL2和15-25ng/mL IL3；
第4天，补加无血清培养基至95-105mL，同时添加450-550U/mL IL2、15-25ng/mL IL3，继续培养至第6天；
(3)NK细胞的继续培养
第7天，补加无血清培养基至195-205mL，并添加45-55ng/mL IL15、95-105ng/mL NK细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集NK细胞
第14天，离心收集NK细胞，使用流式抗体鉴定NK细胞表型；
所述步骤(1)中于36-38℃、4％-6％CO2培养箱中静置培养过夜；
所述步骤(3)中添加的α-半乳糖神经酰胺具体浓度为100ng/mL；
所述步骤(4)中于500g×10min离心条件下收集NK细胞；
所述无血清培养基具体为KBM581无血清培养基。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％CO2。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中细胞培养瓶为T175细胞培养瓶。
4.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中添加的IL15具体浓度为50ng/mL。
5.根据权利要求1所述的NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中同时使用FITC-anti-CD3、PE-anti-CD16和PerCp-anti-cd56流式抗体鉴定NK细胞表型。
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