[发明专利]原代肝细胞分离和培养方法

权利要求书

1.一种原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，包括：

步骤S1：获取质量小于0.05g的肝组织样本；将所述肝组织样本切碎，得到组织碎块；

步骤S2：将所述组织碎块用胶原酶溶液消化，过滤，得到初步消化的组织碎块，将所述初步消化的组织碎块移入第一消化液中消化，过滤后获得第二组织碎块；

所述胶原酶溶液由四型胶原酶和HANKS液配制而成，所述胶原酶溶液中四型胶原酶的浓度为0.2-0.8mg/mL，所述第一消化液为TrypLE消化液；

所述消化条件是在35-39℃温度下，以5-15r/min的振动频率振动10-40min；

步骤S3：将所述第二组织碎块接种在培养装置中进行扩增培养。

2.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述组织碎块大小为0.5-2mm³。

3.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤S3中，将所述第二组织碎块密度调整为1-2个/cm²后，再接种在所述培养装置中。

4.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤S3中，将所述第二组织碎块接种在所述培养装置中，加入肝细胞扩增培养基进行扩增培养。

5.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，步骤S3中，将所述第二组织碎块进行研磨，过滤，离心，收集细胞；向所述细胞中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，离心分离得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀重悬于所述肝细胞扩增培养基中，得到细胞悬液，将所述细胞悬液接种于所述培养装置中进行扩增培养。

6.根据权利要求5所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述离心条件为：离心力为40-60g，离心时间为1-3min。

7.根据权利要求5所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，调整所述细胞悬液的密度为0.5-2×10³个/cm²后，再接种于所述培养装置中。

8.根据权利要求1所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述胶原酶溶液中还包含胎牛血清白蛋白，所述胎牛血清白蛋白的浓度为2-8mg/mL。

9.根据权利要求5所述的原代肝细胞分离和培养方法，其特征在于，所述培养装置采用胶原蛋白或细胞外基质蛋白预包被；所述细胞外基质蛋白选自Matrigel基质胶。