[发明专利]一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测的引物和探针以及优化方法，具有良好的灵敏性和特异性，方法，其步骤如下：a.提取待检明胶样品中DNA；b.以提取的DNA为模板，加入上述的引物和带荧光染料的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样本反应的扩增曲线和Ct值，根据扩增曲线和Ct值判定结果；实时荧光PCR反应体系为：2×Real‑time PCR预混液；10µmol/L貉特异基因上游引物；10µmol/L貉特异基因下游引物；10µmol/L貉特异基因探针；1~100 ng/μL模板DNA；通过上述方法，明胶中是否含有貉源性成分，而完成了食品检测体系。

技术领域

本发明属于食品检验技术领域，具体涉一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法。

背景技术

实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术发展而来的，在扩增反应体系中添加一个特异性探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，以进行结果判定，可以有效降低检测结果假阳性，具有灵敏度强、特异度高、操作简单、快速等优点。

明胶是从动物表皮、结缔组织和骨组织中的胶原部分水解得到的不溶性蛋白质，由于其特殊的物理特性、营养价值和药用功能，被作为辅料或药物广泛应用于食品、医药和其他工业领域。

用于明胶生产的动物材料多为屠宰场提供的牛、猪、羊等的皮毛和骨头。目前对动物明胶的来源检测缺乏相应的检测手段，国内对动物胶的检测，也只集中在对鹿胶、龟胶和阿胶的真伪鉴别上。在明胶市场中，经常出现明胶掺假现象。掺假主要体现在不法商贩通过降低成本以谋取经济利益，在明胶加工过程中，以低价格的原料骨（肉）掺入到高价格的原料骨中。貉作为一种毛皮动物，饲养者将其杀完去皮张后，往往又将其骨（肉）贱卖给不法商贩，令貉骨（肉）得以添加到某些价格较高的动物骨中如牛骨、羊骨、猪骨等，以次充好。迄今我国还没有对明胶制品中貉子源性成分的定性检测方法，食品质控工作面临无据可依的困境。

以貉骨（肉）冒充高成本动物骨，这一违法行为既无法保证明胶生产原料的卫生要求，可能产生食品安全问题，又属于以次充好的行为，影响明胶的质量，欺诈消费者。

所以在食品质量控制工作中，找到动物明胶中貉源性成分的检测方法，识别并打击假冒伪劣明胶，对于保障消费者权益和身体健康有着重要意义，对于保护我国明胶产品质量及其经济效益也具重要意义。目前在食品检验技术领域中，检测明胶中貉源性成分的工作有待开展，为了更好地应对工作需求，本领域技术人员迫切需要掌握一种快速、简便以及准确地检测和鉴定明胶中貉源性成分的技术。

发明内容

本发明的目的是为解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种明胶中DNA提取的优化方法，提供一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测的引物和探针以及优化方法。

本发明所述的貉，中文学名貉子，是指哺乳动物，属哺乳纲，食肉目，犬科，貉属。被毛长而蓬松，外形粗短、肥胖，嘴尖细，四肢细短。

本发明的一方面在于，公开明胶中DNA提取的优化；

蛋白沉淀法：称取25mg明胶样品4管，分别加入到 1.5 mL 离心管中，在管中加入 1mL核酸裂解液, 置 65℃ 恒温箱中温育 20min， 在 65℃条件下加入 600uL蛋白沉淀液，室温下12 000 r/ min 离心 10 min，小心转移上清液至一新 1.5 mL 离心管中， 再加入0.8 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 2 h 左右，12 000 r/ min 离心 10 min，弃上清液，加入 600 uL 70% 乙醇洗涤 1 次， 12 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，室温干燥后，将DNA 溶于 10uL 去离子水中，- 20℃ 保存；