[发明专利]一种貉裘皮制品真伪的荧光PCR检测方法

权利要求书

1.一种利用MGB探针荧光PCR法鉴定貉裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于包括特异性引物和探针的序列如下：

貉上游引物NP-F：5’—GGCCGCAGGAATCACAATA—3’

貉下游引物NP-R：5’—CAGGGTCAAAAAAGGTTGTGTTAA—3’

貉探针NP-P：5’—(VIC)TCCTAACGGATCGAAAC(MGB)—3’。

2.根据权利1所述的利用MGB探针荧光PCR法鉴定貉裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于构建20μl荧光反应体系，由以下组分组成：FastStart Universa Probe Master(Rox)10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，探针0.5μl，DNA模板8.5μl。

3.一种采用如权利1、权利2所述的利用MGB探针荧光PCR法鉴定貉裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A、提取样品DNA

B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：FastStartUniversa Probe Master(Rox)10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，探针0.5μl，DNA模板8.5μl。

所述的引物和探针：

貉上游引物NP-F 5’—GGCCGCAGGAATCACAATA—3’

貉下游引物NP-R 5’—CAGGGTCAAAAAAGGTTGTGTTAA—3’

貉探针NP-P 5’—(VIC)TCCTAACGGATCGAAAC(MGB)—3’

C、对扩增后的曲线情况进行结果判定，按照以下判定原则：

Ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于40判为阴性；Ct值介于35～40之间判为可疑，模板量加倍重复实验，如果Ct值减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。

4.根据权利3所述的检测方法，其特征在于步骤B所述的荧光PCR扩增按照以下步骤进行：

95℃ 10min；95℃ 10s；58℃ 30s；40个循环，循环在退火时收集荧光信号。

5.根据权利3所述的检测方法，其特征在于步骤A所述的样品DNA提取按照以下步骤进行：

A、样品的预处理

取貉裘皮制品的针毛10根，平均长度约7cm。将貉毛放入2mL离心管中，使用75％乙醇浸泡5min，再用ddH₂O洗涤3次，晾干。

B、样品DNA的提取

将处理后的样品剪碎成0.2～0.5厘米的长度，置于2mL离心管中，加入280μlTNE、30μl10％SDS、20μl蛋白酶K、20μl DTT，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000 r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，空管离心1min。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液70μl洗脱、制备DNA，-20℃冷冻备用。