[发明专利]基于KASP技术的玉米雄性不育胞质类型的鉴定方法

说明书

本发明提供一种基于KASP技术的玉米雄性不育胞质类型的鉴定方法。叶绿体基因组玉米雄性不育S型胞质鉴定特异引物19对，包括17个SNP和2个InDel位点的引物；C型胞质鉴定特异引物10对，包括9个SNP和1个InDel位点的引物；T型胞质鉴定特异引物7对，均为SNP引物。该方法可用于鉴定玉米雄性不育胞质和正常胞质的种质材料，鉴定不育制种和常规制种的杂交种，鉴定不育材料的纯度等。该方法的应用为玉米胞质不育制种、不育材料选育提供了技术支持，为玉米三系配套种子生产提供有力保障；在基因组水平上拓展了玉米可用标记位点的范围，为玉米细胞质遗传特性等研究提供新思路和手段。

技术领域

本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种基于KASP技术的玉米雄性不育胞质类型的鉴定方法。

背景技术

玉米是最早实现杂种优势利用的作物，其杂交种的选育和利用被誉为作物生产上的一次革命。玉米杂交种制种方法有常规和雄性不育两种方法，利用雄性不育配制玉米杂交种，不仅节省大量劳动力，降低成本，而且还可以提高杂交种纯度，提高产量。

玉米雄性不育(male sterile，MS)是指玉米的雄蕊发育异常产生无功能花粉而雌蕊发育正常能够正常授粉结实的现象。玉米雄性不育大体可分为细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)和细胞核雄性不育(genetic male sterility,GMS)两类。细胞质雄性不育(CMS)是由细胞核和细胞质基因共同控制的核质互作型雄性不育系，容易实现不育系、保持系和恢复系的配套，是玉米育种和良种生产上利用的主要雄性不育类型。至今已发现了200多种不同胞质来源的CMS材料，依据雄花育性恢复的专效反应，将CMS材料分为S型、C型和T型三种类型，不同类型的材料雄花育性反应及细胞质效应表现不同。

采用CMS制种需要解决三个问题，第一雄性不育胞质类型鉴定，第二雄性不育材料纯度鉴定，第三利用不育系配制杂交种的鉴定，因此建立一种玉米CMS胞质类型鉴定的高通量方法具有十分重要的意义。叶绿体基因组信息由于具有以下优势而被广泛应用于植物品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，系统进化，细胞质遗传特性等研究和应用中。(1)叶绿体基因组较小且相对保守，其全序列容易获得；(2)叶绿体基因是母系遗传，不同个体间基因的交换和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性；(3)叶绿体基因组除反向重复区外均为单拷贝基因，几乎不存在旁系同源基因干扰；(4)叶绿体编码区与非编码区进化速度差异显著，存在一些高突变区，可以解决种以下分类单元问题。由于CMS是与细胞质密切相关的，采用叶绿体基因组上标记位点鉴定不育胞质类型是一种稳定、可靠、创新的方法。开发适于CMS材料鉴定的叶绿体SNP或InDel标记位点，多个位点组合的同时使用，可以增强鉴定可靠性减少不确定性。基于叶绿体基因组开发用于玉米CMS类型鉴定的标记位点和方法尚未报道。

KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)为竞争性等位基因特异性PCR技术体系，具备试验流程简单、高效、灵活、易操作等特点，适合SNP/InDel等二态性标记类型的基因分型检测。其配套仪器平台兼容96，384，1536三种格式酶标板，适于多种样本通量的检测，其中1536孔格式不仅体现了高通量的优点而且降低了成本。

已报道玉米雄性不育鉴定方法有大田育性观察，细胞学差异比较，育性恢复专效性鉴定，标记位点PCR扩增等方法。前三种方法鉴定周期长，鉴定材料范围受限；基于PCR方法目前没有报道针对叶绿体基因组开发InDel位点的鉴定方法，均是基于琼脂糖、聚丙烯酰胺等电泳平台的检测方法，不能实现高通量、自动化的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于KASP技术的玉米雄性不育胞质类型的鉴定方法。