[发明专利]无种质基因型限制的高频体胚再生培养基及其应用

说明书

本发明公开了一种体细胞胚诱导培养基，包括改良MS培养基、2～4mg/L 2,4‑D、0.2mg/L NAA、0.1 mg/L 6‑BA、40g/L蔗糖、0.7%琼脂，pH值为5.8~6.0。本发明还公开了胚状体增殖生长组合培养基和无种质基因型限制高频体胚再生培养基。本发明还公开该体细胞胚诱导培养基和上述组合培养基的应用。本发明通过选择合适外植体、及依据外植体关键发育阶段及时调整培养基配方和激素成分浓度、及相应培养条件等，使这些因素达到良好相互协同作用，有效地克服了结缕草培养中不同种（品种）及基因型限制问题及高频体胚再生问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率。

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及无种质基因型限制的高频体胚再生培养基及其应用。

背景技术

结缕草属(Zoysia genus)植物主要分布于亚洲东部广大区域内，其南北跨约20个纬度，东西占30个经度；在我国主要分布区域从东北辽宁到南方广西等地的沿海狭长地带。由于结缕草生态环境复杂多样，其典型严格的异花授粉特性，导致了结缕草种间杂交及天然杂种大量存在，种内变异很大，也使得天然野生种群个体间保持了丰富的自然变异、基因型差异及遗传多样性。

结缕草以其高的耐践踏性、对紧实土壤的强适应性及高弹性、强抗旱耐瘠薄性和耐盐碱性及适宜低养护粗放性管理等特性而成为高质量足球场及运动场草坪的首选，及发展潜力巨大的优良生态、固土护坡及水土保持的草地植物；也成为世界公认的优良草坪草；我国结缕草种质资源位居世界首位，也是世界上唯一生产野生结缕草种子并具有出口创汇能力的国家。鉴于结缕草的优良特性，美国、日本等发达国家率先进行了新品种的常规选培育，但目前结缕草在生产上的使用大多还是以野生资源为主，育成品种(除兰引3号外)的广泛应用还很少见到。

利用生物技术结合常规育种方法进行结缕草新品种的选培育，既是提高结缕草育种效率的有效途径，也属世界育种前沿。采用生物技术进行品种或种质基因型改良及种质快繁最有效的途径就是建立高频体细胞胚再生技术体系；因为体细胞胚是单细胞起源的，体细胞胚再生途径不但重演了合子胚形态发生的过程，实现了再生种子的来源，也是种质保存、种苗脱毒快繁、诱导体细胞变异或基因转化的理想受体；体细胞胚快繁除能保证优良种群个体基因型的遗传一致性和稳定性，还能保持新种质的特异性。所以，体细胞胚再生技术也是植物组培克隆中最具吸引力的研究方向。

从理论上讲，各种植物的体细胞都具有全能性，在离体培养中通过体细胞胚胎发生途径均可形成再生植株，然而事实上有些植物容易，有些植物很难，主要是直到现在人们对这些植物的再生培养条件也还没有完全了解与掌握。草坪草也像许多单子叶植物一样被认为是很难利用体细胞胚胎发生途径诱导再生植株，特别是一些暖季型草坪草相关报道很少。通常大部分草坪草在较高浓度的生长素和较低浓度的细胞分裂素的固体培养基上就能形成愈伤组织，但是否能诱导出胚性愈伤组织及胚性愈伤组织中的胚性细胞是否能够通过体细胞胚胎发育途径形成胚状体则与外植体的年龄、生理状态、培养基的组成、激素的种类和浓度、培养条件等有关。其中，培养基的组成、激素的种类和浓度是培养条件的关键因子，合适的培养条件就是在适合的培养基上适时附加合适的激素及适量的浓度，从而达到植物在相应分化的阶段对生长发育的需要。激素对不同种类植物的生理效应有着相互促进或相互抵抗的效果，其影响涉及激素的合成、运输、代谢和效应等各个方面。植物细胞生长和分化的调节往往是多种激素综合作用的结果，而且它们之间的相互作用极其复杂。