[发明专利]一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于筛查肺癌的蛋白芯片的制备方法，通过构建吸烟者肺癌组织T7噬菌体展示cDNA文库，将文库中的cDNA片段插入到T7噬菌体载体中，使插入片段以融合蛋白形式展示在噬菌体外壳蛋白上，将外源蛋白或多肽基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达，通过生物淘洗和噬菌体展示技术制备了蛋白芯片，将病人的异常基因融合表达为异常蛋白，并借助蛋白芯片的高通量筛选和抗原抗体特异性结合的原理来确定肿瘤标志物，本发明的方法可在早期发现或筛查原发肿瘤，筛查肿瘤高危人群，鉴别肿瘤的良恶性，判断肿瘤的发展过程，观察肿瘤的治疗效果，预测肿瘤的复发和预后中发挥重要作用。

技术领域

本发明涉及一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法。

背景技术

一直以来，吸烟被认为是诱发肺癌的首要危险因素，因此，研究人员一直在探索吸烟诱发肺癌的机理，并试图寻找可以作为吸烟人群肺癌风险预测的标志物，早在上世纪末，研究者们就对吸烟人群中的分子变化进行了研究，结果显示，在吸烟以及曾经吸烟但并未诊断出肺癌的人群中，p53基因变异以及甲基化已呈现出明显趋势，变化程度分别可达到70％和100％，Church等也在2009年首次利用血清中烟草特异性致癌物对吸烟人群的肺癌患病风险性进行了研究，结果显示，NNAL(烟草甲基亚硝胺)是所有检测指标中唯一一个与肺癌危险性相关的标志物，并且还可以明显区分腺癌与非腺癌患者，另外，对吸烟正常人与非吸烟正常人之间对比发现，24h的尿液中尼古丁和NNAL两种标志物的检测浓度在吸烟样本中显示明显的特异性，表明这两种标志物具有区分吸烟与非吸烟人群的特性。

近年来，为了探索汉族人群中肺癌风险相关基因，我国科研人员通过全基因组关联研究(GWAS)，在中国汉族人群中鉴定出了与肺癌相关的4个新位点，在此研究中，研究人员对上万例样本进行检测，鉴定出了4个与肺癌相关联的风险位点，其中13q12.12和22q12.2为汉族人群中的新发风险位点，这项研究结果表明肺癌易感人群在基因水平上的差异性，为本研究在蛋白抗体水平寻找易感人群的差异提供了理论依据。

自身免疫抗体作为免疫监视原理的产物，具有早期检测癌症发生与发展过程的能力，是近年癌症早期诊断标志物的研究方向，1998年，Mitsudomi T等人对NSCLC患者血清中p53蛋白的自身免疫抗体水平进行了研究，提出p53蛋白AAb可能具有一定的诊断价值，此后对于肿瘤AAb的研究得到了更广泛的认识，Pereira-Faca等对早期肺癌细胞系中PGP9.5、膜连蛋白Ⅰ和14-3-3theta三者进行联合检测发现敏感性提高到55％，而特异性为95％，这些研究体现出了AAb联合筛查在早期肺癌检测中的优势，Rom等人在2010年报道了运用自身免疫抗体对肺癌患者、肺部有磨玻璃状阴影吸烟者、良性固体结节吸烟者、CT正常吸烟者以及正常非吸烟者血清进行了比对检测，结果表明，c-myc，CyclinA，Cyclin B1，Cyclin D1，CDK2和Survivin自身抗体组合能够明显区分肺癌中的吸烟人群与非吸烟人群，敏感性为81％，特异性为97％，但该组合尚不具备对吸烟人群中肺癌发生风险预测的能力，也没能用于肺癌早期筛查的功能。

随着对蛋白质组学研究的不断深入，高通量蛋白芯片技术、电离质谱、qRT-PCR等技术已经发展为肿瘤标志物开发及癌症早期筛查中的重要实验手段，本课题组利用蛋白芯片与cDNA噬菌体展示相结合的技术，筛选出由5个NSCLCAAb所组成的标志物组合，其对早期NSCLC的诊断敏感性和特异性都达到91.3％，且ROC(Receiver O peratingCharacteristics)曲线下面积达到0.99，甚至可以对潜伏期NSCLC实现83％的检测准确率，利用电离质谱技术，Yildiz等筛选出7个蛋白标志物组合模型，特异性达86％，但敏感性只有58％，最新的研究结果显示，MicroRNA作为血清检测指标在肺癌早期筛查中的效果相对较理想，Chen等利用qRT-PCR方法对10个miRNA标签进行检测，诊断敏感性为93％，特异性为90％，而Wu及其研究小组对血清中自身免疫抗体的检测结果显示，6种自身免疫抗体对早期肺癌的诊断敏感性和特异性都达到92％。