[发明专利]一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒

说明书

本发明公开了一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒。所述circRNA标志物为circ_0047921、circ_0007761或circ_0056285中的一种或多种。在NSCLC患者血浆外泌体中，上述circRNAs的表达水平与其他肺部疾患病人和健康人群血浆外泌体有显著差异。本发明还提供了分别用于检测circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285的特异性引物组及其试剂盒。本发明的标志物可单独用于NSCLC的诊断，具有一定的准确性，其组合可以显著提高诊断的准确度（AUC为0.894，敏感度和特异度分别为87.25%和80.00%），并且可以鉴别NSCLC患者与其他肺部疾病患者包括肺结核、慢性阻塞性肺等疾病病患，有助于实现NSCLC的早期发现。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒。

背景技术

肺癌是我国乃至全世界最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均位居癌症首位。最新数据显示2015年我国居民新发肺癌约73.33万例，占全部恶性肿瘤的17.09%；死亡人数达61.02万，占全部恶性肿瘤的21.68%。80%以上的肺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）。NSCLC的5年生存率仍低于20%。研究发现，肺癌未转移者的5年生存率（60%～80%）要显著高于局部转移者（生存率25%～50%）和远端转移者（生存率低于5%）。可见，早期发现、早期治疗是提高肺癌治愈率的关键。

由于肺癌发病隐匿且缺乏有效的早期诊断方法，50%以上的肺癌患者在病理确诊时就已发生转移，错失了治疗良机。目前采用的早期诊断方法即影像学检查，包括低剂量螺旋计算机断层扫描、正电子发射型计算机断层扫描显像结合非开胸手术活检，都存在灵敏度低或假阳性等问题。近年来，基于分子诊断的液体活检技术在肿瘤诊断中受到广泛关注，一些肿瘤特异的分子标志物如癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）及循环微小RNA（microRNA）等的检测加上辅助的影像学检查，能提高诊断的灵敏度。这些分子标志物可在血液等体液中直接检测，具有简便、快捷、无创、廉价、可重复检测等优点，容易为病人接受，对肿瘤的临床诊断具有重要意义，有很好的临床应用前景。

外泌体（Exosomes）是一种直径为30～100纳米之间的小囊泡，可由多种细胞分泌，内含大量的蛋白质、脂质和RNA分子。外泌体既参与了机体正常的生理活动，也影响着人类疾病的发生发展。与正常细胞一样，肿瘤细胞也分泌外泌体。来源于肿瘤细胞的外泌体，其内含物成分直接由肿瘤细胞产生并储藏在其内，研究显示外泌体内基因的表达水平与宿主细胞具有高度一致性。外泌体体积微小，易于进入血液中，且其自身稳定，膜结构可有效保护其内含分子被降解，是循环RNA的有效载体。有研究者指出血浆外泌体比血液更能反映肿瘤细胞的成分特征，在肺癌组织中高表达的、被认为是肿瘤标志物的表皮生长因子受体在肺癌病例血浆外泌体中的表达显著高于健康人群血浆外泌体中的表达，但直接在血浆中检测EGFR的表达，两者却无显著差异。由此可见，血浆外泌体含有肿瘤分子标志物，收集方便，是理想的液体活检载体。

NSCLC细胞分泌的外泌体进入血液融合为血浆外泌体，其携带的肺癌特异性表达的分子有望作为肺癌早期诊断的分子标志物。相对于外泌体内含的蛋白质和脂质分子，RNA分子的检测手段更为简便、快捷、廉价，是最为理想的检测标志。然而，大部分的RNA为线性RNA，稳定性差，易于降解，临床应用价值有限。不同于线性RNA，环状RNA（circRNA）是一种具有环状特征的RNA分子，呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。大量研究显示circRNA与肿瘤包括NSCLC发生发展密切相关，其在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式，提示circRNA具有作为肿瘤早期诊断标志的潜力。此外，已有少量研究报道血浆外泌体中检测出circRNA。