[发明专利]一种热介质流动式PCR扩增的方法

说明书

本发明提供了一种热介质流动型PCR扩增的方法，其具有高效、快速、易于小型化并且能对复杂容器内部进行PCR扩增的优点。该方法包括：将加有PCR反应溶液的反应容器插入或连接在热介质容器中，使反应容器能接触或浸泡于热介质，热介质驱动装置使不同温度的热介质流过热介质容器，导致接触热介质的反应容器温度发生变化，从而在反应容器完成PCR扩增。本发明的反应速度很快，10分钟即可以完成常规PCR需要1.5小时才能完成的工作，并可以在复杂的容器内部进行PCR扩增。总之，本发明的速度快、通用性强、易于小型化、能用于复杂容器的内部温控、应用范围广泛，特别是能应用于POCT等需要高度自动化、小型化的领域。

技术领域

本发明主要是提供一个高效、快速易于小型化的PCR扩增方法。可用于生命科学研究、检验检疫、司法、医学诊断和研究等相关领域。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是核酸研究的最重要的方法，广泛应用于生命科学研究、检验检疫、司法、医学诊断和研究等相关领域。

PCR扩增利用不同的温度使核酸完成变性、复性、扩增延伸的过程，反复进行上述过程可以大量的扩增出所需的靶基因序列。一般使用三步法进行扩增，即升温95℃让反应液中的核酸变性解离成单链，降温到50℃复性让单链的核酸与反应液中的引物结合，再升温到70℃以利于DNA聚合酶进行复制，由此升到95℃、降到50℃、再升到70℃为一个循环，一般PCR扩增都要进行40余个循环。也有简化的二步法，即升温到95℃变性，降温到65℃左右复性和扩增延伸一起进行，也就是升到95℃、然后降到65℃成为一个循环。

最早的PCR扩增是用人工或机械手将反应容器在不同温度的水浴或油浴容器中转换，从而完成扩增。由于这种方法速度慢，设备大，已经被淘汰。

后来Roche公司发明lightcycler，将反应容器放在一个密闭的腔体中，用加热器对腔体中的空气加热，然后用室温的空气吹冷到室温，再加热。即需要把空气从室温加温到95℃，然后用室温空气吹冷至室温，再加热到50℃，再加热到70℃，再加热到95℃，再吹冷至室温，反复进行。由于空气的导热性不高，所以要求把反应容放在离心盘上不停的转动，以便于反应容器与更多的空气接触，以保证能达到所需温度。同时，空气的比热不大，热平衡时间长，因此lightcycler使用毛细管作为反应容器，以加大与热介质(空气)的接触面积，但毛细管在离心转动的过程中又易出现断裂。现在已经基本被淘汰。

现在最常用的是使用半导体加热型，如ABI公司、Roche公司等的相关产品。将反应容器放入相应规格的金属孔内，压紧使反应容器壁与金属孔紧密接触。然后用半导体对金属进行加热和制冷。此方法不用毛细管，不用离心转动，操作简单，成为主流方法。但是金属比热大，升温和降温所需的时间长，同时要求反应容器与金属孔形状和尺寸一致，否则热传递效率就会大幅降低。

在PCR扩增仪器中的热交换实际上包括三个过程：

1、加热器对热介质的升降温过程。

2、热介质与反应容器的热交换过程。

3、反应容器壁与反应液的热交换过程。

其中存在着2个矛盾：

1、热介质比热越大，对于热交换速度就越快，但其自身升降温度速度越慢。

2、反应容器壁越薄，反应容器内的液层越薄，热交换速度越快。但是液层越薄，同样的体积就意味着越长，而细长的容器，再加上薄壁就越容易损坏。

无论是现在常用的半导体加热还是已经被淘汰的以Rochelightcycler加热、降温、热传递都是串联的，一步完成以后再进行下一步。因此比热小升降温快了，热交换时间就长，比热大了升降温变快，但热交换时间又变长；使用毛细管能提高热交换效率，但反应容器又易损坏。总之，常用PCR技术以上矛盾只能取选择不能解决。

发明内容