[发明专利]负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途

权利要求书

1.负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备妊娠纹修复或妊娠纹治疗的药物或化妆品中的应用，其特征在于，

负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体包括人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体；

所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：

采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs 或iPSCs，收集培养基，采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体；

旋转超滤结合低温超速离心方法步骤包括：将一定容积的培养基于4℃ 400g 离心10min，去除游离细胞，得到的上清移入另一管中，4℃ 15000g 20min，去除细胞碎片，获得的上清液倒入millipore超滤装置中，用PBS洗脱收集滤膜上的浓缩液体，即再次加入PBS，经millipore超滤装置再次超滤，得到的浓缩液转移至1.210g/cm³的30% 蔗糖/重水密度垫，4℃ 100800g离心210分钟，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中，4℃ 3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终定容至一定体积，得到人多能干细胞外泌体悬液，分装保存至-80℃；

无血清培养体系选择市售的型号为TeSR™-E8™或mTeSR1或mTeSR2的培养基；

通过共孵育法将白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体得到负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体：

配制1 mg/mL的白藜芦醇的生理盐水溶液，随后用1 N的氢氧化钠水溶液调节溶液pH至6左右，取浓度1.0 * 10¹²/mL的人多能干细胞外泌体溶液100 µL，向其中加入1 mL的白藜芦醇溶液，37℃ 孵育1 h后，用5 mL的生理盐水超滤洗涤溶液两次，留取200 µL液体，得到负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶液，随后，取50 µL该溶液，利用200 µL的乙腈进行稀释，12000 rad/min下离心，除去蛋白沉淀，白藜芦醇的包裹浓度为35 μg/mL。