[发明专利]含有人巨细胞病毒UL147基因的重组质粒、基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种含有人巨细胞病毒UL147基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。该含有人巨细胞病毒UL147基因的重组质粒为将UL147基因插入表达型载体pET32a中获得；然后将该重组质粒转进表达菌BL21(DE3)中构建了能表达聚组氨酸标签HCMV UL147融合蛋白的工程菌株，菌株可表达获得对应的HCMV UL147融合蛋白。该融合蛋白可应用亲和层析纯化制备多克隆抗体，从而有利于探究趋化因子蛋白HCMV UL147如何规避宿主免疫系统的逃避机制，降低HCMV潜伏感染宿主细胞的数量提高机体的免疫识别。

技术领域

本发明涉及生物学领域，特别涉及一种含有人巨细胞病毒UL147基因的重 组质粒、基因工程菌及其应用。

背景技术

巨细胞病毒感染是由人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)引起的 常见病毒性感染之一，其特征是受感染的细胞体积明显增大，细胞中出现包涵 体。在新生儿、免疫低下和免疫抑制病人(如艾滋病、器官移植或肿瘤)可引 起严重感染，甚至导致死亡。HCMV在正常人群中传播极为广泛，很少导致明 显疾病，大多数人呈潜伏感染。但这对免疫减弱或损伤的人群(免疫缺陷、器 官移植、肿瘤、艾滋病病人和孕妇)构成极大威胁。因此，亟待对于致病和免 疫机制研究，其中包括从分子水平上研究急性和潜伏感染期受染细胞的特点， 病毒对受染细胞致病效应和机体对受染细胞的免疫反应。所有病原微生物均包含和产生一种或多种独特的蛋白质，原则上即使这些分子的完整形式从未达到 胞膜，这些蛋白质可通过蛋白酶解产生小的片段，被MHC分子捕获，运送到细 胞表面，从而以多价阵列的方式被T细胞识别。这些肽可来源于感染细胞中入 侵病原微生物的特殊蛋白质，也可来源于病原体胞内复制中新生成蛋白质。识 别这些感染标志，增加感染细胞对病原体存活的抵抗、消灭感染细胞，从而消 除病原体的爆发性复制(W.E保罗，Fundamental Immunology,2003)。

趋化因子是一类可调节免疫反应的小分子家族具有细胞趋化性和细胞因子 活性。HCMV vCXCL2_TB40/E在野生型毒株和临床毒株中功能域高度保守，具有 针对HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DR高度保守的T细胞抗原表位，可以活化CTL 有助于机体清除病毒感染的细胞，防止病毒的进一步传播。Hegde等研究发现 HCMV gpUS3可在内质网中与MHC-Ⅱ类分子的α和β链结合，抑制其由内质 网向高尔基体转运，使其在细胞表面表达下降。HCMV gpUS2可与HLA-DR-α 和HLA-DM-α链结合并使其降解。HCMV gpUS2和gpUS3可以可溶性表达于细 胞外，被未感染的APC细胞摄取，抑制未感染的APC细胞呈递抗原给CD4⁺T 细胞。此外，MarcellaBS等研究发现人趋化因子受体类似物：HCMV基因组含 4中CC类趋化因子同源物编码基因，即UL33、UL78、US27和US28，但只有 gpUS28有趋化因子受体活性。US28类似CC类趋化因子受体，可高亲和力的结 合CC类趋化因子MCP-Ⅰ、RANES和MIP-Ⅰ。研究表明，HCMV感染可使培 养细胞的RANTES和MCP在24小时内明显上升，但此后却明显下降，而RT-PCR 证实，此时趋化因子mRNA水平并未明显下降，并进一步证实细胞表面结合的 趋化因子增加，说明CC类趋化因子被吸附在被感染细胞表面，而游离因子减少， 因而不能建立有效的趋化因子梯度，不能趋化吞噬细胞到达炎症部位，从而达 到免疫逃避的目的。

pET载体最初由Studier及其同事构建。Novagen开发的系列新的pET载体 则使目的蛋白的克隆、检测以及纯化更加容易。pET32系列载体是设计用来克 隆构建和高水平融合表达表达带有109个氨基酸Trx标签的蛋白质序列。