[发明专利]一组基于转录组测序开发的川金丝猴EST-SSR引物和试剂盒

说明书

本发明公开了一组基于转录组测序开发的川金丝猴EST‑SSR引物和试剂盒。本发明提供17对川金丝猴EST‑SSR标记引物如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:34所示，这些EST‑SSR标记在9只川金丝猴个体中具有多态性，联合使用可鉴定不同的金丝猴个体，是稳定存在的SSR标记，可用于川金丝猴种质资源遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等。

技术领域

本发明涉及一组基于转录组测序开发的川金丝猴EST-SSR引物及试剂盒，属于分子生物学分子标记技术领域。

背景技术

微卫星标记(microsatellite)，又被称为短串联重复序列(short tandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍体(或多倍体)的纯合体或杂合体，这是AFLP、RAPD等显性标记所无法做到的。另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。

SSR标记分为基因组SSR标记和表达序列标签SSR标记(EST-SSR)。相比基因组SSR标记，EST-SSR标记在近缘种属中保守性更好，效率更高。而且基于表达数据的SSR标记是基于某一时期的基因表达序列，与基因功能和性状表型直接相关，因而有着重要的研究价值。

川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)，隶属于灵长目(Primates)、猴科(Cercopithecidae)、疣猴亚科(Colobinae)、仰鼻猴属(Rhinopithecus)，系我国特有种，是我国I级重点保护保护野生动物，被国际自然保护联盟(International Union forConservation of Nature，IUCN)名录列为易危(IUCN，2011)。目前川金丝猴仅分布于几个相互隔离的地区(四川北部及甘肃南部、陕西秦岭和湖北神农架3个地区)，研究川金丝猴的遗传多样性和种群结构对我国珍稀濒危种质资源的保护具有十分重要的意义。目前用于穿金丝猴遗传多样性检测的SSR标记多来自于其他近缘灵长类，但是这种依靠SSR标记在同属或同科物种的转移特性的方法，很容易因为侧翼序列的突变而转移失败。虽然川金丝猴的全基因组测序虽然已经完成，但金丝猴专属的SSR标记作为一种简单易行的可用于川金丝猴遗传多样性和亲缘关系鉴定的重要方式，目前仍未被开发出来。开发一组川金丝猴专属的SSR标记引物和试剂已然迫在眉睫。

发明内容

针对目前急需但缺乏川金丝猴专属SSR标记的现状，本发明的首要目的是提供了一组基于转录组测序的开发川金丝猴EST-SSR标记引物。本发明从基因组的外显子序列中搜索EST-SSR位点，并设计对应PCR扩增引物，先通过外显子的ePCR验证，最后利用4个川金丝猴个体转录组测序数据进行无参组装得到的转录本进行ePCR，筛选得到17对具有多态性的EST-SSR标记及其引物。利用这些EST-SSR标记成功在9个川金丝猴个体中验证其多态性。本发明为研究川金丝猴的遗传多样性和亲缘关系提供了一种准确高效快速的途径。

一组基于转录组测序开发的川金丝猴EST-SSR引物对，所述引物共有17对，分别为：

第1对引物，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

第2对引物，其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

第3对引物，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

第4对引物，其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；