[发明专利]一种用于检测菊花矮化病病原体的引物及方法

说明书

本申请涉及一种用于检测菊花矮化病病原体的引物及方法。具体而言，本发明人在菊花矮化植株上鉴定到一种香石竹潜隐病毒属的新种病原体，该病原体是首次报道。由于没有针对该病原体的检测方法，本申请根据病原体的全基因组序列设计了特异性检测引物，建立了检测该病原体的方法。该方法的灵敏度可达2.1×10³拷贝，在多种菊花品种上均有效，扩展了菊花病毒病的检测范围。

技术领域

本申请属于植物病害诊断领域，涉及一种检测菊花病原体的方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是菊科的一种植物，不仅是观赏花卉，还可以药用和饮用，是我国传统中药材之一。

菊花的生产受病毒危害严重。迄今，世界上报道的危害菊花的病毒有20余种。目前，我国报道的侵染菊花的病毒有7种：菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)；类病毒2种：菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid，CSVd)和菊花枯黄斑点类病毒(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid，CChMVd)(吴红芝等.昆明地区菊花病毒病的调查与鉴定.云南农业大学学报,2002,17(1):24-27；Niu EB 2015First Report ofZucchini yellow mosaic virus in Chrysanthemum.Plant Dis 99:1289；Zhao X2015.Amultiplex RT-PCR for simultaneous detection and identification of fiveviruses and two viroids infecting chrysanthemum.Arch virol 160:1145–1152)。

2017年，在对华北地区的菊花进行病害调查时，发现大量菊花矮化植株。通过小RNA高通量测序的方法，确定菊花矮化病的病原体为香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)一种新病毒。在本申请的上下文中，将该病毒称为菊花R病毒(Chrysanthemum virus R，CVR)。

菊花以无性繁殖为主，为避免病毒经留根或扦插枝条传播至下一代，生产中多使用脱毒种苗。建立全面、高效、快速的病毒检测体系是筛选脱毒苗的重要步骤。针对我国常见的菊花病毒病，目前已建立了TAV、CVB、CMV、TMV、PVY、CSVd和CChMVd的多重反转录(reverse transcription，RT)PCR检测体系(Zhao X，2015.A multiplex RT-PCR forsimultaneous detection and identification of five viruses and two viroidsinfecting chrysanthemum.Arch virol.160:1145–1152)。但是，目前还未有针对新病毒CVR的有效检测方法。

RT-PCR是目前最常使用的病毒检测方法之一，是一种核酸水平的检测方法。对于生物学检测、电子显微镜检测、血清学检测等检测方法具有：(1)灵敏度高，能够将极微量的核酸快速扩增至可检测水平，灵敏度可达pg级；(2)特异性强：不受相体内杂蛋白的影响)；(3)快速(样本检测可在24h内完成)等优点。

本申请本申请针对菊花上的一种新病毒CVR设计了特异性检测引物，为CVR的检测提供了有效的工具。

发明内容