[发明专利]猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法

说明书

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法。包括以下步骤：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻；将培养基在高压锅内高压灭菌，待到温度降低后，把病料倒入高压锅内，厌氧培养，传代3次；取三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤培养，培养结束后离心，取上清液；向上清液加入灭活剂，充分振摇，灭活脱毒，得灭活菌液；将灭活菌液与佐剂混合，得灭活疫苗。本发明提供的方法工艺简单、成本低、污染小，制备出的灭活疫苗安全性高，注射后无不良反应，免疫效力高、免疫期长。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法。

背景技术

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，可产生多种外毒素及酶类，能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死。根据产气荚膜梭菌所合成分泌的主要毒素，分为A、B、C、D、E五种毒素型；其中A型产气荚膜梭菌主要引起胃肠道的病变，是人畜气性坏疽病，兔梭菌性下痢，马坏死性肠炎及人食物中毒的主要致病菌，也是引起鹿出血性肠炎的主要致病菌。该型菌产生的多种外毒素中，最主要的是α毒素。猪A型产气荚膜梭菌是造成仔猪、育肥猪、怀孕母猪以及种猪“猝死”的主要原因，以胃肠道弥漫性出血而引起的肠毒血症和坏死性肠炎为特征，发病急，病程短，无任何前期征兆而突然死亡。

目前，产气荚膜梭菌灭活疫苗的也有较多的研究，中国专利申请CN102698259A公开了一种鸡坏死性肠炎(A型)灭活疫苗制备方法，将A型产气荚膜梭菌CVCC37株种子液按培养基总量的1％-2％接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃厌氧发酵培养/或静置培养6小时，培养结束后经3000r/min离心30min去除菌体，分别用8Ku截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经0.6％的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20％额氢氧化铝配制成疫苗。中国专利申请CN104623651A公开了一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备方法，该方法以A型产气荚膜梭菌为原始菌种，经过一级和二级培养后最终获得菌液，将该菌液与白油佐剂混合即制得A型产气荚膜梭菌灭活疫苗；其中，所用灭活剂为最终质量分数为0.3％的甲醛，佐剂为白油佐剂。曲海波等([1]曲海波,刘洪斌,白同臣.A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与全菌灭活疫苗的安全性和免疫效力的比较研究[J].中国兽药杂志,2010,44(02):15-16.)研究了六批兔A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗和其全菌灭活疫苗，并且对其安全性和免疫效力进行了比较研究；结果表明，类毒素灭活疫苗无毒副作用，局部刺激小，安全性好于全灭活疫苗，免疫效力结果二者无明显差异，两种疫苗的攻毒保护率均不低于4/5，免疫期均在6个月以上；其中灭活剂采用0.4％的甲醛溶液，佐剂采用氢氧化铝胶。

目前，A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的研究针对的牲畜多为鹿、兔、牛，针对猪A型荚膜梭菌灭活疫苗的研究较少，而且简单的替换并不能得到安全性好、稳定性高、免疫效果好的猪疫苗，并且现有技术中产气荚膜梭菌的灭活试剂采用的是有致癌效果的甲醛，佐剂多采用含有重金属的氢氧化铝胶。这些疫苗在使用中尚存在一些需要进一步解决的问题：(1)家畜接种反应较重；(2)注射剂量大，使用多有不便(3)制备过程繁琐，时间较长。因此，需要改进制备过程和筛选培养基和佐剂，以快速制备出高效的疫苗，来提高疫苗免疫原性和集体免疫应答水平。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述缺陷，提供猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法。该方法简便可行、操作简单、成本低、污染小，制备出的灭活疫苗安全性高，注射后无不良反应，免疫效力高、免疫期长。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法，包括以下步骤：

(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻；