[发明专利]一种饲养细胞蛋白复合物及其应用

说明书

本发明涉及一种饲养细胞蛋白复合物及其应用，制备方法包括如下步骤：（1）获取人源或鼠源的胚胎成纤维细胞并进行培养；（2）当胚胎成纤维细胞传代到3代时换成无血清的培养基；（3）将收集到的上清液浓缩。本发明制备方法简单，步骤易于操作，制备的得到的饲养细胞蛋白复合物能够用于培养人胚胎干细胞，且能够促进人皮肤伤口划痕两侧的细胞生长。

技术领域

本发明涉及一种饲养细胞蛋白复合物及其应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）是一种源于人囊胚内细胞团，经体外分离、培养获得的原始多能干细胞。由于其人源性，人胚胎干细胞受到高度关注，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。人胚胎干细胞的分离和体外培养成功具有极其重要的研究和临床应用价值，其可用于体外研究人类胚胎发生发育的过程，有助于理解分化发育的机制、认识生命和疾病的现象。人胚胎干细胞最为深远的潜在用途是通过定向分化诱导产生各种特化的细胞和组织，将其用来修复或替换丧失功能的组织和器官，从而治疗许多疾病，如脊髓损伤、脑卒中、烧伤、心脏病、糖尿病、白血病、骨关节炎等。人胚胎干细胞的培养条件十分苛刻，既需要维持其未分化状态和分化潜能性，又要使其无限增殖，因此传统上需要将人胚胎干细胞置于CF-1来源的饲养细胞上培养。培养液中除基础培养基外，还要加入抑制分化的因子，如beta-巯基乙醇等，同时还需要细胞生长促进因子，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等。饲养细胞提供人胚胎干细胞生长的附着位点，并分泌多种细胞因子抑制人胚胎干细胞分化，促进其增殖。常用的饲养细胞有小鼠成纤维细胞系STO细胞、3T3细胞、各种系小鼠的胚胎成纤维细胞等。目前最被广泛认可并使用的是CF-1小鼠来源的饲养细胞，研究发现，其上清中含有多种人胚胎干细胞亟需的生长因子，使用CF-1小鼠来源的饲养细胞制备的条件培养基中的细胞因子量少，只能作为传统培养基的辅助使用。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供了一种饲养细胞蛋白复合物及其应用。

本发明采用如下技术方案：一种饲养细胞蛋白复合物，制备方法包括如下步骤：

（1）胚胎成纤维细胞的获取：获取人源或鼠源的胚胎成纤维细胞，并将胚胎成纤维细胞放入5％CO2培养箱中培养，培养瓶中注明细胞名称、代数及日期

（2）当胚胎成纤维细胞传代到3代，当细胞铺满培养瓶后，弃掉之前的培养基，换成无血清的培养基；

（3）第二天开始进行收集，连续收集5天，将收集到的上清液浓缩，采用切向流超滤器进行切向流过滤，在温度为3-5℃下浓缩至原溶液体积的1/100～1/10，标记饲养细胞蛋白复合物，-20℃保存。

进一步的，所述步骤（1）中人源胚胎成纤维细胞的制备方法为：将收集到的人胎盘或人脐带采用DPBS缓冲液冲洗3-5次，并将组织充分剪碎，采用0.25%的胰酶或胶原酶消化2-10min后得到胚胎成纤维细胞。

进一步的，所述步骤（1）中鼠源的胚胎成纤维细胞的制备方法为：将怀孕10~18天的CF-1小鼠处死后浸入酒精中消毒，在无菌条件下获取CF-1小鼠的胚胎， 采用PBS缓冲液冲洗胚胎3-5次，并将组织充分剪碎，采用0.25 % 的胰酶消化2-10 min后得到胚胎成纤维细胞。

进一步的，所述步骤（3）中浓缩后的蛋白复合物可以加入BSA， BSA的加入量为浓缩后的蛋白复合物质量的1～5 %。

饲养细胞蛋白复合物的应用，所述饲养细胞蛋白复合物能够用于培养人胚胎干细胞。

饲养细胞蛋白复合物的应用，所述饲养细胞蛋白复合物能够促进伤口划痕两侧的细胞生长。