[发明专利]一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，包括：采集外周血，分离单个核细胞，把单个核细胞放入被CD16单抗和HER2单抗包被过的培养瓶中培养；同时在培养基中加入IL‑2、IL‑15、IL‑21和灭活的自体血清；随后把细胞转移到没有包被过的培养瓶中培养，每2‑3天给细胞补液一次；最后收集NK细胞即可。本发明不使用任何异源血清成分和滋养层细胞，操作过程简单，可以得到很高的NK细胞产量，具有良好的临床应用价值。

技术领域

本发明属于细胞分化和培养领域，特别涉及一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer，NK)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓或胸腺微环境，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。在杀伤靶细胞的过程中，NK细胞可以非特异性识别靶细胞，并且不受主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)的限制，对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。NK细胞表达CD56但是缺失CD3，通常用标志物组合CD3-CD56+来定义NK细胞。NK细胞主要存在于外周血和脾脏中，大概占到外周血淋巴细胞的5％～15％(Huntington ND,et al.,Nat RevImmunol2007Sep,7(9):703-14)。

NK细胞在无需抗原预先致敏的情况下就能直接杀伤肿瘤细胞和被感染的细胞。NK细胞可以通过多种方式杀伤靶细胞：1、与靶细胞接触后，NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞；2、通过自身表达的配体，来激活靶细胞表面的死亡受体；3、通过抗体依赖的细胞毒性作用对靶细胞造成杀伤；4、活化的NK细胞通过释放TNF引发靶细胞的细胞凋亡(Smyth MJ,et al.,Nat Rev Cancer2002Nov,2(11):850-61)。

NK细胞是人体的第一道抵御防线，是机体抵抗恶性肿瘤细胞和抗病毒感染的重要免疫调节细胞，也是连接天然免疫和特异性免疫的重要桥梁。最新的研究表明，NK细胞能清除体内衰老的细胞，因此NK细胞在预防衰老相关的疾病和抗衰老领域也可能有重要的价值(Krizhanovsky V,et al.,Cell 2008Aug 22,134(4):657-67)。外周血中的NK细胞数量有限，所以必须通过体外培养的方法获得大量的NK细胞满足临床应用的需要，通常是利用外周血单个核细胞诱导出NK细胞。但是常规的制备NK细胞的方法有很多问题需要解决：1.所获得的NK细胞纯度偏低，产量不高，不同个体来源的NK细胞的产量差异很大，有些个体的血液细胞很难扩增出NK细胞。2.在培养NK细胞的过程中如果使用滋养层细胞可以显著提高NK细胞的纯度和产量，但是使用滋养层会大大降低临床应用的安全性。3.在培养NK细胞之前，可以用磁珠分选外周血单个核细胞，这样能提高NK细胞的纯度。但是免疫磁珠的方法过程繁琐，成本较高，还可能会引入外源性物质(磁珠、洗脱液中的成分和抗体等)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，该方法不使用任何异源血清成分和滋养层细胞，操作过程简单，可以得到很高的NK细胞产量，具有良好的临床应用价值。

本发明提供了一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，包括：

采集外周血，分离单个核细胞，把单个核细胞放入被CD16单抗和HER2单抗包被过的培养瓶中培养；同时在培养基中加入IL-2、IL-15、IL-21和灭活的自体血清；随后把细胞转移到没有包被过的培养瓶中培养，每2-3天给细胞补液一次；最后收集NK细胞即可。

所述CD16单抗的包被浓度为1～10μg/mL，包被温度为4℃，包被时间为8～16小时。优选包被浓度为10μg/ml，优选包被时间为16小时。

所述HER2单抗的包被浓度为1～1000μg/mL，包被温度为4℃，包被时间为8～16小时。优选包被浓度为100μg/mL，优选包被时间为16小时。