[发明专利]用于血浆中核酸定量PCR检测的外参照

说明书

本发明提供了一种用于血浆中核酸含量测定的外参照(PLACON)，以及含有外参照模板序列、反转录和PCR引物、检测试剂盒、试剂盒的使用方法及在制备血浆中核酸检测产品中的应用。

技术领域

本发明涉及一种用于血浆中DNA、mRNA、miRNA含量测定的外参照系统，以及使用该核酸序列进行含量测定的方法。

背景技术

目前，在组织和细胞中，常用β-actin、GAPDH等内参来检测DNA、mRNA，用U6等内参照来检测miRNA，但血浆中基因检测没有标准的参照物，GAPDH、β-actin、U6等扩增不稳定，不能作为血浆DNA、mRNA、miRNA表达检测中的内参照。一些研究使用了外参照，但这些研究比较零散，可能与人类基因组存在一定的同源性，从而带来非特异性扩增的问题。

发明内容

为解决上述内参照或外参照在血浆中扩增不稳定的问题，本发明提供了一种用于血浆中核酸含量测定的外参照(PLACON)：5’-CUCGCUAACGACUCUACAACGACCGUGAAUUCAAGCGCCGCUUGGAUGUCCGC-3’(SEQ ID No.1)。通过Bioneer公司化学合成，经过实验证明这段序列能够在血浆中稳定扩增。经试验证明，外参照PCR扩增的Ct值在23.24-23.87，平均值为23.56。

这段序列经过了NCBI的Blast，结果如最后附图所示，外参照模板序列及其上下游引物与人类基因库无同源序列，特异性强，qRT-PCR不会带来非特异性的扩增。

本发明还提供了一种用于血浆中核酸含量测定的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID No.1所示的外参照模板序列。所述试剂盒还包含外参照的正向引物(SEQ IDNo.3)和反向引物(SEQ ID No.4)。所述试剂盒还包含无菌水、dNTP、PCR缓冲液、rTaq酶、阳性或阴性对照、荧光染料中的一种或多种。

进一步的，本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)获得血浆中的总RNA，提取时加入SEQ ID No.1所示的外参照模板序列；

(2)总RNA进行逆转录PCR，逆转录PCR反应体系中含有Gene Specific Primer RT：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAGCGGACAT-3’(SEQ ID No.2)；

以逆转录PCR产物为模板进行荧光实时定量PCR，荧光实时定量PCR反应体系含有外参照模板序列的正反向引物：

正向引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’(SEQ ID No.3)，

反向引物：5’-CGACTCTACAACGACCGTGA-3’(SEQ ID No.4)。

(3)PCR反应结束后，分析结果。

本发明所述试剂盒的使用方法为非疾病诊断目的的方法。

更进一步的，本发明提供了上述外参照模板序列和试剂盒在血浆基因检测产品中的应用。

本发明的有益效果

本发明提供了一种可以在血浆中稳定扩增的序列，可用于血浆中核酸检测的标准。

附图说明

图1为外参照模板序列的Blast设置。

图2为外参照模板序列Blast结果。

图3为外参照上下游引物的Blast设置。

图4为外参照上下游引物的Blast结果。

图5为外参照的扩增曲线。

图6为外参照的溶解曲线。