[发明专利]犬重组干扰素-λ1及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种犬重组干扰素‑λ1及其制备方法与应用。该犬重组干扰素‑λ1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了犬重组干扰素‑λ1的制备方法，利用毕赤酵母菌株表达系统表达含有本发明密码子优化了的犬重组干扰素‑λ1基因的重组酵母工程菌，获得分泌表达的高活性犬重组干扰素‑λ1，本发明方法制备得到的犬重组干扰素‑λ1纯度高，纯化后达到0.86mg/ml，1L重组酵母工程菌的蛋白产量为42mg。抗病毒比活性为2.85×10⁷IU/mg，能够有效预防和治疗犬瘟热、犬细小病毒、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等传染性疾病，具有较高的安全性，应用前景良好。

技术领域

本发明属于生物制品领域，公开了一种高活性的犬重组干扰素-λ1，同时还提供了高效表达犬重组干扰素-λ1的制备方法与应用。

背景技术

近年来，我国的宠物业迅速发展，宠物犬、猫的数量日益增多，宠物源病毒性疫病是目前危害比较严重的疾病。最常见的犬瘟热、犬细小病毒病等通常危害严重，发病率高，传染性强，死亡率高，是危害我国养犬业最为严重的传染病，严重制约了宠物业的发展。传统的治疗方案在临床上很难奏效，因此进行积极治疗和预防犬的病毒病是业内最为关注的问题。

根据氨基酸序列和特异性识别受体的不同，IFN分为I型、II型和III型。其中I型干扰素包括有IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-κ、IFN-ω和IFN-τ，其中IFN-α有二十余个亚型，各型结构类似，仅存在少量氨基酸的差异，IFN-α为目前应用最广的抗病毒药物之一。IFN-β仅有一个亚型。II型IFN为IFN-γ，具有很强的免疫调节功能；干扰素-λ是2003年由美国科学家Kotenko等和Sheppard等共同发现的一类新型干扰素，由于其兼具I型干扰素和白细胞介素(interleukin,IL)-10家族的双重特征，因此其成员的命名为IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)，其生物学效应与I型IFN比较相似，包括抗病毒,免疫调节及抑制肿瘤增殖等生物学活性。IFN-λ通过与其特异性受体异二聚体复合物(IFN-λR1/IL-10R2)结合，可介导JAK-STAT信号转导途径，诱导机体的抗病毒反应，从而发挥其抗病毒作用。由于III型IFN的受体主要分布在上皮细胞表面，因此，推测III型干扰素主要通过表皮和黏膜上皮组织来阻止病毒的入侵，在组织中，主要分布在胃部、肠道和肺部，在中枢神经系统中分布较少，这种分布可以使得其靶向性更佳，并降低临床使用中的副反应。

IFN-λ1/IL-29由含22个氨基酸的信号肽和178个氨基酸的成熟肽组成,分子质量约20ku～33ku，含有2个二硫键，在65位～67位氨基酸残基上存在1个潜在的N-连接糖基化位点。IFN-λ2/IL-28A和IFN-λ3/IL-28B均由含22个氨基酸的信号肽和174个氨基酸的成熟肽组成，含有3个二硫键，分子量约22ku，氨基酸同源性为81％。

毕赤酵母是一种新型的外源基因表达系统，已有多种蛋白在此系统中高效表达，不存在原核表达系统的内毒素难以去除的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并可进行类似高等真核生物的信号肽剪切和糖基化等翻译后加工。表达载体pPICZαP的醇氧化酶启动子AOX1可用甲醇严格调控，表达盒的N端带有引导分泌表达的带α-factor信号肽序列，表达产物可分泌到上清，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给筛选转化子的工作带来很大的便利。再者甲醇营养型酵母表达系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌巴斯德毕赤酵母自身蛋白分泌量少，下游分离纯化操作易行，能大规模发酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性高的犬重组干扰素-λ1。

本发明的另一目的在于提供该犬重组干扰素-λ1的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述方法制得的犬重组干扰素-λ1的应用。