[发明专利]基于MGB探针的石貂毛皮制品的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于MGB探针的qPCR法进行石貂毛皮制品真伪的检测方法，包括石貂上游引物：MfF；石貂下游引物：MfR；石貂探针：MfP；检测方法：提取样品的DNA；对样品DNA进行qPCR扩增；对扩增曲线分析后判定结果。通过特异性实验、灵敏度实验、重复性实验和盲测实验表明，本发明特异性好、灵敏度高，不需要进行普通PCR产物的后续分析，节约成本，缩短了检测周期，提高了检测效率。

技术领域

本发明属于分子物种鉴定技术领域，具体涉及一种基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测石貂毛皮制品真伪的方法。

背景技术

石貂皮坚韧轻薄，毛被丰厚、绒毛细软，是毛皮中珍贵的高级制袭原料皮。石貂列入中国《国家重点保护野生动物名录》，为二级保护动物。

由于貂皮市场巨大，利润丰厚，因此不乏许多不法商家以其他相似皮毛来冒充名贵貂皮或珍稀貂皮。同时，随着皮毛加工鞣质的技术越来越成熟，加工工序越来越复杂，传统的毛皮鉴定方法如宏观观察法、扫描电镜法、DNA测序等已经不能满足目前的皮毛鉴定的需求，因此也无法准确对毛皮制品进行物种鉴定。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。探针法是qPCR中的一种常见方法，在反应体系中加入化学修饰的寡聚核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，无法检测到荧光信号。而当PCR扩增时，Taq DNA酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。MGB探针是在传统Taqman探针基础上改进，通过在探针3’端加入MGB基团，提高探针的退火温度，缩短探针的长度，提高了探针的特异性和灵敏度。

本发明建立了一种针对石貂毛皮制品的实时荧光定量PCR检测方法，利用MGB探针，能够高效、准确和快速的检测石貂毛皮制品的真伪，同时能对以其他皮毛制品充当石貂皮毛制品的现象进行分析鉴定。线粒体Cytb基因是目前国内外广泛认可的用于动物物种鉴定的基因，本发明针对Cytb基因设计引物和MGB探针。

发明内容

本发明的第一个目的是设计针对石貂的特异性引物和探针。

本发明的第二个目的是为了克服现有分子生物学检测技术的不足之处，建立一种使用方便、快捷、准确的貂皮制品真伪的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

1、DNA的提取体系

取石貂针毛10根(平均3～4cm)或绒毛5mg置于2ml离心管中，剪碎，加入280μlTNE、30μl SDS、20μl DTT、20μl蛋白酶K，加入150μl Buffer C-L(AXYGEN动物基因组提取试剂盒)，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。离心步骤参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液，离心1min。将DNA制备管转移到新1.5ml离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液80μl洗脱、制备DNA，-20℃冷冻备用。

2、引物和探针的设计