[发明专利]时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括PVC底板、全血滤垫、抗体承载膜和吸水纸；所述全血滤垫、抗体承载膜和吸水纸依次搭接粘贴在PVC底板上；所述抗体承载膜包括基底膜和所述基底膜上依次涂有的相互平行的微球线、检测线和控制线，其中所述微球线靠近全血滤垫，所述控制线靠近吸水纸；

所述控制线由兔抗小鼠IgG组成，所述检测线由AMH单克隆抗体组成，微球线由结合AMH单克隆抗体的时间分辨荧光微球组成。

2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条，其特征在于，所述微球线距全血滤垫4～6mm；所述微球线和检测线间距为4～6mm；且所述检测线和控制线的间距为4～6mm。

3.根据权利要求2所述的时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条，其特征在于，所述微球线、检测线和控制线均为实心线状。

4.根据权利要求3所述的时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条，其特征在于，所述抗体承载膜的基底膜为硝酸纤维素膜。

5.根据权利要求4所述的时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条，其特征在于，所述试纸条还包括外壳，所述外壳将全血滤垫、抗体承载膜、吸水纸和PVC底板装入其中，所述外壳包括上壳和下壳，上壳将全血滤垫、抗体承载膜和吸水纸压紧在PVC底板上，且上壳在对应全血滤垫和抗体承载膜的部分分别设有加样孔和观察窗。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤：

(1)时间分辨荧光微球的预处理

将时间分辨荧光微球用超声分散处理1min后，取200μl，17500rpm高速离心20min后去除上清液，沉淀物用10～100mmol/L，pH为6.0的MES缓冲液洗涤；加入碳二亚胺和琥珀酰亚胺，使二者终浓度均为0.1mg/ml，室温反应10-30min后，17500rpm高速离心20min，沉淀物用pH为6.0的MES溶液洗涤并重悬至1ml，获得时间分辨荧光微球溶液；

(2)结合AMH单克隆抗体的时间分辨荧光微球的制备

每250μl上述时间分辨荧光微球溶液中加入50～200μg AMH单克隆抗体，混匀，室温反应1.5～2.5小时，用含1-2％BSA的10～50mmol/L、pH为7.5～8.5的Tris-HCl封闭液室温封闭2小时后，17500rpm高速离心20min，用含0.2-1％BSA、0.2-0.3％Tween20、0.1％NaN₃的10～50mmol/L、pH为7.5～8.5的Tris-HCl保存液洗涤并重悬至250μl，于4℃避光保存，获得结合AMH单克隆抗体的时间分辨荧光微球溶液；

(3)抗体承载膜的制备

用含有1％蔗糖的10mmol/L PBS缓冲液分别稀释兔抗小鼠IgG和小鼠抗人AMH单克隆抗体至浓度0.5～1.5mg/ml，取上述结合AMH单克隆抗体的时间分辨荧光微球溶液100μl，17500rpm高速离心20min，用200μl-500μl含0.5-1％BSA、0.2-0.3％Tween20、10％蔗糖的10～50mmol/L、pH为7.5～8.5的Tris-HCl微球重悬液重悬；用定量喷膜仪以1～5μl/cm的量在硝酸纤维素膜上间隔4～6mm平行喷涂控制线、检测线和微球线；放入烘箱，35～38℃避光烘干，加入干燥剂封存备用；

(4)试纸条的组装

在PVC底板上依次搭接粘贴全血滤垫、抗体承载膜和吸水纸，使得微球线靠近全血滤垫，控制线靠近吸水纸，得到试纸板，再将试纸板切割得到所述时间分辨荧光免疫层析法检测AMH的试纸条。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括，用外壳将全血滤垫、抗体承载膜、吸水纸和PVC底板装入其中，并将全血滤垫、抗体承载膜和吸水纸压紧在PVC底板上，且外壳中的上壳在对应全血滤垫和抗体承载膜的部分分别设有加样孔和观察窗。