[发明专利]一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建方法

权利要求书

1.一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系，其特征在于，所述稳定细胞系为MDCK细胞，其以慢病毒作为载体，在所述MDCK细胞的基因组中先后随机插入E1A基因和E1B基因，所述E1A基因和E1B基因均来源于犬腺病毒CAV2；该稳定细胞系能够分别表达所述E1A基因和所述E1B基因。

2.一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，将犬E1A基因和犬E1B基因分别构建到慢病毒载体中，分别得到表达E1A基因的慢病毒和表达E1B基因的慢病毒；用所述表达E1A基因的慢病毒感染MDCK细胞，得到MDCK-E1A细胞系；再用所述表达E1B基因的慢病毒感染所述MDCK-E1A细胞系，获得能稳定表达所述E1A基因和所述E1B基因的稳定细胞系MDCK-E1A-E1B。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从载体pCAV2上分别扩增E1A和E1B基因，先将E1A片段用同源重组的方法克隆到含有报告基因mCherry的慢病毒载体pFUGW上，构建重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A；再用同样的方法将E1B片段克隆到含有报告基因GFP和筛选基因puro的慢病毒载体pCDH上，构建重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro；

(2)在培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G和RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-mCherry-E1A病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-mCherry-E1A病毒的滤出液；

(3)在培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G、RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-GFP-puro-E1B病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液；

(4)测定重组慢病毒的滴度，将LV-mCherry-E1A病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK细胞的培养皿中共培养，通过观察荧光表达情况连续传代培养，直到最后视野中的细胞90％以上都是红色荧光，表示筛选出能稳定表达E1A基因的MDCK-E1A细胞系；

(5)将LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK-E1A细胞系的培养皿中共培养；最后添加Puromycin抗生素筛选阳性细胞系，最终获得MDCK稳定表达E1A和E1B基因的MDCK-E1A-E1B细胞系。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述pFUGW-his-mCherry-2a-E1A重组质粒构建过程包括如下步骤：

(1)以pCAV2为模板，采用PCR方法扩增E1A片段，随后在E1A上加上融合序列和酶切位点；以H2B-mCherry-P2A-N2c(G)质粒为模板，采用PCR方法扩增得到含有融合序列的his-mCherry-2A片段；用同源重组PCR的方法将E1A和his-mCherry-2A片段融合，得到PCR片段；

(2)将步骤(1)所得的PCR片段电泳检测、纯化，测定OD值；

(3)采用Xba1和EcoR1酶对慢病毒载体pFUGW进行双酶切，切胶回收线性载体；

(4)利用T4DNA连接酶将步骤(2)中PCR片段与步骤(3)中线性载体于16℃过夜连接；

(5)采用热转化方法，将上述连接产物转化DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上；次日挑单克隆摇菌、提质粒，使用Xba1和EcoR1双酶切验证正确，送测序。