[发明专利]生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺

说明书

本发明公开了一种生物转化制备α‑酮戊二酸的分离纯化工艺，属于微生物技术领域。本发明生物转化制备α‑酮戊二酸的分离纯化工艺包括电渗析、纳滤、活性炭脱色、反渗透浓缩、浓缩结晶和干燥。本发明采用陶瓷膜分离、电渗析脱盐、膜浓缩和精制等先进处理工艺的组合，有效实现了a‑酮戊二酸生物技术的洁净化生产。该工艺的关键点为用电渗析取代了传统离子交换，提高了产品提取率，提高了产品纯度，同时减少了原有工艺的酸碱用量和水耗，降低了后续工艺的活性炭用量，减少了环境污染。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺。

背景技术

L-谷氨酸氧化酶（EC 1.4.3.11，L-glutamate oxidase，GLOD）是以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的一种L-氨基酸氧化酶，是80年代初开始发现的一种新酶，最早从蛇的毒液、鼠的肾脏、无脊椎动物和微生物等生物体中分离纯化得到。L-谷氨酸氧化酶能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸脱氨，生成α-酮戊二酸和过氧化氢。GLOD 对催化反应底物有高度的立体异构选择性，催化效率高，反应条件温和，已被广泛用于食品、轻工、化工、医药、环保、能源和科研等各个领域。该酶自 20 世纪 80 年代被发现以来，一直是工具酶研究的热点之一。现阶段酶的主要研究集中在，一是借由现代的观察及测定手段研究酶的结构以及作用机制，二是利用酶的特性以及工程学的方法研究如何利用酶来服务于人类的生产、生活。

近年来，国内外科学家先后分别从土壤中分离到能产生 GLOD 的链霉菌、放线菌，并建立了较完善的液体发酵产酶体系，制备了 GLOD 粗品，通过对其酶学性质进行研究，纯化得到的该酶都具有以下特性： 能专一性地催化L-谷氨酸生成过氧化氢、氨和a-酮戊二酸。目前，GLOD 发酵生产距工业化生产还有很大距离，这在很大程度上限制了其应用。因此需要进一步研究其发酵工艺，通过工艺优化，改进发酵培养基成分和发酵条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，显著提高发酵产量。

L-谷氨酸氧化酶一方面可以应用到测定 L-谷氨酸及其偶联反应；另一方面则可以用于a-酮戊二酸的制备，进而制备L-谷氨酸-a-酮戊二酸。国内目前为止还没有厂家对其进行生产，国外也只有一家生产重组于大肠杆菌的 L-谷氨酸氧化酶。价格的昂贵、来源的单一，严重制约着 L-谷氨酸氧化酶的应用和发展。

本公司于2016年8月27日申请了申请公告号为“CN 106318888 A”、发明名称为“一株产谷氨酸氧化酶的菌株MQO-160及其应用”的发明专利公开了一株产L-谷氨酸氧化酶的菌株MQO-160、该菌株再制备L-谷氨酸氧化酶方面的应用、该菌株再生产α-酮戊二酸方面的应用、利用该菌株制备L-谷氨酸氧化酶的方法、利用该菌株生产纯化α-酮戊二酸的方法。该发明专利中，利用该菌株生产纯化α-酮戊二酸的方法中，分离纯化生物转化制备α-酮戊二酸的分离纯化工艺包括步骤：

离子交换：将含有α-酮戊二酸转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用0.25N盐酸溶液洗脱；

纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤α-酮戊二酸洗脱液纯化液得到α-酮戊二酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清晰浓缩液后，弃去浓缩液，收集含α-酮戊二酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到97%；

活性炭脱色：pH 3.0，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为α-酮戊二酸纳滤清液的1%质量分数，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；

反渗透浓缩：将α-酮戊二酸脱色液经反渗膜浓缩至原体积一半得到α-酮戊二酸预浓缩液；

浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液，将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h；

干燥：结晶结束后，抽滤获得晶体，将结晶晶体50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品。