[发明专利]一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法及该支架的体外细胞毒性测试方法

权利要求书

1.一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征在包括以下步骤：

（1）双醛基纳米纤维素的制备：在纳米纤维素溶液中加入高碘酸钠，避光反应，后经离心、透析至溶液中的自由离子完全去除，得到双醛基纳米纤维素溶液；

（2）明胶溶液的制备：在磷酸缓冲液中加入明胶，不断搅拌直到完全溶解后得到明胶溶液；

（3）双醛基纳米纤维素/明胶复合水凝胶的制备：将双醛基纳米纤维素溶液与明胶溶液共混，迅速搅拌均匀后，静置孵化交联；

（4）3D组织工程支架的打印：计算设计好支架三维结构模型后导入3D打印机中；在料筒中装入双醛基纳米纤维素/明胶复合水凝胶材料，然后设置料筒温度、工作平台温度、针头直径、挤出压力、喷头行走速度、孔径参数，完成组织工程支架的3D打印后，直接使用或冷藏备用。

2.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（1）中,所述的双醛基纳米纤维素可为棒状短晶须或线型纳米纤维，所获得的双醛基纳米纤维素溶液的质量浓度为2%～10%。

3.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（1）中,所述的双醛基纳米纤维素由纳米纤维素经高碘酸钠氧化制得，纳米纤维素与高碘酸钠的固体质量比为1:1～3，反应温度为20～80℃，反应时间为3～20小时，反应结束后经离心、反复透析至双醛基纳米纤维素溶液中自由离子完全去除为止。

4.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（2）中，所述的明胶溶液的质量浓度为2%～10%。

5.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（3）中，所述的双醛基纳米纤维素/明胶复合水凝胶的制备，双醛基纳米纤维素溶液与明胶溶液共混的体积比为1:9、2:8、 3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1中的任意一组比值。

6.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（3）所述的双醛基纳米纤维素/明胶复合水凝胶的制备，共混温度为20～40℃，孵化时间为1～5h，孵化温度为15～40℃，搅拌速度200～2000rpm，后得到双醛基纳米纤维素/明胶复合水凝胶，孵化过程中，双醛基纳米纤维素分子与明胶分子通过席夫碱反应发生交联。

7.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（4）所述的3D组织工程支架的打印，三维结构模型中，相邻两层的丝之间的角度为1～90ᵒ，分层的厚度为120～400μm。

8.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（4）所述的3D组织工程支架的打印，料筒温度为5～35℃，工作平台温度为1～30℃，针头直径为150～400μm，挤出压力为0.1～0.4Mpa，喷头行走速度为10～40mm/s，孔径为100～500μm。

9.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程支架的3D打印制备方法，其特征是，步骤（4）所述的3D组织工程支架孔隙率不低于75%，空隙连通率不低于75%；所述的3D组织工程支架冷冻储存条件为：-80～-15℃环氧乙烷密封包装，无菌储存。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的皮肤组织工程支架的3D打印制备方法中支架的体外细胞毒性测试方法，其特征是，种植细胞前，将支架放置于ｒ射线下照射2h进行灭菌处理；然后支架于37℃条件下浸没在培养基中过夜，随后每孔中加入3T3细胞悬浮液，放入37℃、二氧化碳浓度5%、湿度95%的培养箱中进行培养；然后利用CCK-8评价3T3在支架的增殖情况，利用酶标仪在450nm波长处，检测OD值。