[发明专利]一种检测样品菌种相对含量的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测样品菌种相对含量的方法。所述方法步骤如下：引物的设计；基因组的提取；荧光定量PCR；NGS16S测序；NGS分析；预测模型的建立。使用NGS和qPCR两种方法对样品中某种待测细菌的相对含量进行检测，并将NGS的分析结果与qPCR原始实验数据进行拟合和关联以建立一个预测模型，从而使之后qPCR对样品的测试数据可以输入至该预测模型中并直接得出样品中某种待测细菌的相对含量。本方法降低了单独使用qPCR进行细菌相对含量检测实验优化的复杂度和操作的繁琐，提高了样品检测得到最终结果的速度；具有极大市场前景和经济价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测样品菌种相对含量的方法。

背景技术

DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法(一代测序)。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能满足研究的需要。费用更低、通量更高、速度更快的第二代测序技术应运而生。二代测序的基本原理是边合成边测序，在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphaTris-EDTA，脱氧核糖核苷三磷酸，PCR反应体系中合成DNA的必要成分)进行PCR(聚合酶链式反应)，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

qPCR(也称RT-PCR，Realtime Fluorescence Quantitative PCR，实时荧光定量PCR)，该技术在1996年由美国Applied BiosysTris-EDTAms公司推出，是一种新型的定量试验技术，它通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，通过建立标准曲线，可计算待测样品模板的初始浓度。单独利用qPCR的方法计算样品中某一特定种类细菌在所有细菌中的含量占比一般可以采用下述两个方法：

1、标准曲线法：通过使用标准品和特异性引物和通用引物分别建立待测种类细菌和细菌门(所有细菌种类合集)的标准曲线，并计算出各自的标准曲线公式。然后对待测样品使用上述两对引物进行qPCR的扩增并得出两个反应各自的Ct值，然后把Ct值代入标准曲线公式，推算出该样品中待测种类细菌和总体细菌的绝对数量，最后用公式“待测种类细菌绝对数量/总体细菌绝对数量”计算出该样品中待测种类细菌所占总细菌数的比值或称相对含量。该方法操作繁琐，为了解决每个批次间反应扩增效率不一致的问题，需要对每批次的扩增样品都重新建立上述两条标准曲线，不仅占用了多个反应位置，降低了反应通量，而且标准曲线的建立需要更精确的操作，增加了额外的操作时间和出错的概率。

2、2^-ΔΔCt法：由于只是为了测定待测种类细菌占总体细菌的相对含量，因此可以跳过计算绝对数量这一步骤，直接将样品的Ct值代入公式“2^{-[待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值]}”计算待测种类细菌所占总细菌数的含量。该方法较标准曲线法虽然大大减少了额外的反应占用仪器上反应孔的数量，提高了反应的通量。但是此法不仅需要增加一个内参基因的扩增而且要求样品所有基因的扩增效率相等且需要接近100％，因此反应优化十分复杂，很多靶基因由于需要特定引物或特定的PCR反应条件，其扩增效率往往并不能够达到如此高的要求，而且要使各个反应的扩增效率相等更是难以优化。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于简化现有技术的繁琐，从而提出一种检测样品菌种相对含量的方法。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种检测样品菌种相对含量的方法，所述方法步骤如下：

1)引物的设计：根据待测菌的16S rRNA或其他靶基因片段设计引物；