[发明专利]一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶及其制备方法

权利要求书

1.一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶；其结构式如下：

其中酶

二氧化硅纳米粒子；

固定化酶为皱褶假丝酵母脂肪酶。

2.权利要求1的两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其特征是步骤如下：

1)两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法：将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(MAO)与N,N-二甲基乙二胺(DMEA)的开环反应产物p(MAO-DMEA)接枝到二氧化硅纳米粒子表面，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-p(MAO-DMEA)；

2)以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法：以SNPs-p(MAO-DMEA)为载体，通过表面羧基的活化，将酶与载体共价结合，制得以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶；活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)；

两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法步骤如下：

(1)以四氢呋喃为溶剂，以聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)和N，N-二甲基乙二胺为原料，通过二者的开环反应合成两性离子聚合物p(MAO-DMEA)；

(2)利用氨丙基三乙氧基硅烷处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子SNPs-NH₂；将p(MAO-DMEA)溶解在氯仿溶液中，配成浓度为17.5-75mg/mL的溶液，加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，DCC和NHS的浓度分别为12.5-53mg/mL和7.02-29.6mg/mL，对p(MAO-DMEA)表面羧基进行活化，然后加入上述氨基化的二氧化硅纳米粒子SNPs-NH₂，置于20-30℃的恒温水浴摇床中振荡，反应结束后离心分离并依次用DMF、乙醇、去离子水清洗，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-p(MAO-DMEA)；结构式如下：

所述p(MAO-DMEA)与纳米粒子的质量比为0.71～2.88:1；所述步骤(2)中所述的活化时间为1-2h；所述步骤(2)水浴摇床振荡是以120-200rpm震荡12-20h；离心速率是8000-10000rpm。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤2)以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其步骤如下

1)将两性离子聚合物接枝纳米介质加入到MES缓冲液中，配成浓度为22-29mg/mL的悬浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，使得悬浮液中EDC和NHS的浓度分别为40-60mg/mL和12-18mg/mL，室温下振荡反应，活化后离心弃上清并用磷酸缓冲液对活化的纳米介质进行清洗以除去未反应的EDC、NHS及副产物，得到活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质；

2)将目标酶溶解于磷酸缓冲液中，高速冷冻离心收集上层酶溶液，除去不溶物，得到目标酶溶液；

3)将步骤1)中活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质加入到磷酸缓冲液中，再与目标酶溶液混合，使悬浮液中目标酶蛋白的浓度为0.09-0.89mg/mL，然后置于4-10℃恒温空气浴摇床中振荡反应，使目标酶固定在两性离子聚合物改性载体上，反应结束后洗涤、8000-9000rpm冷冻离心，得到以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶；

所述步骤1)中室温下振荡反应30-60min；离心速率为8000-9000rpm；所述步骤3)中空气浴摇床中振荡条件为：速率是100-170rpm下反应10-20h。