[发明专利]一种培育不结球白菜小孢子植株的方法

说明书

本发明公开一种培育不结球白菜小孢子植株的方法，具体包括如下步骤：(1)花蕾的选取：选取花瓣与花药数量比为1:1的花蕾；(2)培育小孢子胚胎：将步骤(1)采集的花蕾用次氯酸钠溶液消毒10‑15分钟，灭菌水清洗，NLN‑13培养基润洗；将润洗后的花蕾充分研磨，过滤，离心，含有10‑30mg/L硼物质的NLN‑13培养基稀释，分装到培养皿中加入活性炭，热激处理，24‑26℃暗培养14‑16天，形成胚状体；(3)成熟胚萌发成植株：将胚状体进行振荡培养，将其中转绿的成熟胚转移到固体MS培养基中进行培养，培育38‑42d后即可直接进行炼苗移栽。本发明所述方法在能够保证出胚率的情况下，简化操作步骤，大大减少了操作时间，提高了植株生产效率。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种培育不结球白菜小孢子植株的方法。

技术背景

小白菜主要是异花授粉植物，在传统育种工作中，需要得到纯化亲本只能通过常规自交，由于自交衰退，纯合亲本的选育就是一个非常困难的问题，并且用时长，耗费人力以及财力，育种效率很低。小孢子培养技术是利用细胞全能性，将单个细胞培养成纯合植株的过程，能够有效的缩短育种年限，很短的时间内就可获得大量的纯合植株，大大的提高了育种效率。lichter1982年首次在甘蓝型油菜上发现，利用小孢子培养技术可以获得胚状体，从此芸薹属蔬菜小孢子培养方面不断取得新的进展，目前在芸薹属青花菜、大白菜、甘蓝、不结球白菜等品种上都取得了成功。在我国，这项技术相对起步比较迟，主要是在借鉴国外的知识上，迅猛发展起来的，1993年曹鸣庆首次成功利用游离小孢子培养技术培育出了胚状体，后来这项技术在我国快速发展，在芸薹属的许多品种中都取得了突破性的进展，并且在芸薹属的青花菜、芥蓝、花椰菜中获得了小孢子再生植株。但目前该技术较为繁琐，出胚率低，且污染问题较为严重。

发明内容

本发明主要是针对目前该技术的繁琐，出胚率低以及污染等问题进行改进，从而提供了一种高效简易的培育不结球白菜小孢子植株的方法。

本发明采取的技术方案：一种培育不结球白菜小孢子植株的方法，具体包括如下步骤：

(1)花蕾的选取：选取花瓣与花药长度比为1:0.5～2的花蕾；

(2)培育小孢子胚胎：将步骤(1)采集的花蕾用次氯酸钠溶液消毒10-15分钟，灭菌水清洗，NLN-13培养基润洗；将润洗后的花蕾充分研磨，过滤，离心，黄绿色沉淀用NLN-13培养基稀释，分装到培养皿中热激处理，24-26℃暗培养14-16天，形成胚状体；

(3)成熟胚萌发成植株：将胚状体进行振荡培养，将其中转绿的成熟胚转移到固体MS培养基中培育38-42d，直接进行炼苗移栽。

本发明步骤(1)中选取花瓣与花药长度比为1:0.5～2的花蕾，优选长度比为1:1的花蕾，上述选取花瓣与花药比值接近1:1这一时期的花蕾，处在单核期和单核靠边期的细胞最多，选用该时期的花蕾，出胚率高。优选的取材时间为早晨9点到11点进行样品的采集，此时外界环境温度低，植物水分含量高，花粉活力强，将选取的花蕾，添加蒸馏水放入4℃冰箱中，尽可能保持花粉活性。

本发明步骤(2)选用次氯酸钠溶液为消毒液，所述次氯酸钠溶液质量浓度为1％，可通过以下方法制备所得：倒取5.6％次氯酸钠溶液2mL，用蒸馏水定容到11.2mL。用1％的次氯酸钠溶液替换了传统上使用酒精和升汞进行消毒的过程，方法简单且降低了污染几率，此外还减少了环境污染。

本发明步骤(2)选用NLN-13培养基代替B5培养基进行润洗和研磨，减少了培养基的配制过程，并且用传统的培养液，替代了研磨液。

本发明步骤(2)充分研磨可选用磨样机，例如型号为：德国LKA控制型试管分散机S025,过滤可选用细胞过滤器，细胞过滤器的的直径优选为22-26mm、孔径为38-42μm，更优选为直径24mm，孔径为40μm。

本发明步骤(2)中黄绿色沉淀优选稀释至细胞数为10⁵个每mL。