[发明专利]一种库蠓近缘种的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法

说明书

本发明公开一种库蠓近缘种的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法，其特征在于采用分子生物学DNA测序的方法获取长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的COⅠ基因序列，再通过基因序列相似性比对，从而根据比对结果对该库蠓近缘种进行种类鉴定。本发明提供的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的分子鉴定方法，有利于实现上述三种库蠓的快速、准确的鉴定。

技术领域

本发明涉及昆虫物种鉴定领域，具体涉及长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法。

背景技术

库蠓（Culicoides Latreille, 1809）隶属于昆虫纲（Insecta）双翅目（diptera）蠓科（Ceratopogonidae），其体型微小、种类繁多、分布广泛，在全世界现有1368种、中国已知347种，并且在世界范围内还在不断发现新物种。吸血蠓是指能通过刺吸反刍动物血液来传播虫媒病原体的蠓，包括库蠓属Culicoides、蠛蠓属Lasiohelea、细蠓属Leptoconops和澳蠓属Austroconops等。在库蠓属吸血蠓中，通过蠓媒传播的病原体有蓝舌病病毒(BTV)、家畜流行性出血热病毒（EHDV）、施马伦贝格病毒（SBV）、非洲马瘟病毒（AHSV）等诸多病原体。吸血蠓是家畜流行病传播过程中的重要一环，若控制不好将爆发流行并造成巨大的经济损失，故与医学和兽医学等领域息息相关。因此，准确鉴定疾病媒介是对蠓传疾病进行监测、防治的关键一步。

目前，蠓的传统形态学鉴定方法首先是以完整的成虫为研究对象，其易受蠓性别和发育阶段的限制导致分类鉴定困难，如蠓卵、幼虫和蛹等早期阶段的形态结构和肢体残缺的虫体均难以辩认且其仅对雄性非吸血蠓虫有较高的适用性，而针对雌性媒介吸血蠓却效果不佳。再者，其还存在操作繁琐、专业性强等不足之处。最后，蠓的表型可塑性和遗传可变性也容易导致误判，尤其是近缘、近似种的分类鉴定。长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等均属二囊亚属的近缘种，传统形态学鉴定极其困难。因此，亟需寻求一种快速、准确的方法，以弥补传统形态学分类方法的不足。

随着分子生物学和生物信息学的快速发展，以DNA序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用技术手段，极大地弥补了传统分类学鉴定的缺陷。DNA条形码技术是指生物体内一段标准的、有足够变异和一定保守性的、且相对较短易扩增的DNA片段。因此，作为DNA 条形码的标准目的基因，其必须满足两个条件，一是必须具有一定的保守性，便于通用引物设计及进行大范围的PCR扩增；二是要有足够的变异性，以区分不同物种，尤其是近缘种。

昆虫线粒体DNA为双链闭环分子，由ND1-6、ND4L、CO I-CO III、ATPase6、ATPase8、Cytb等13个蛋白质基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）共37个基因和包含复制启动子的非编码区段组成。线粒体基因中 CO I、CO II、Cytb、12S rRNA、16SrRNA、ND4、ND5是目前应用频率较多的分子标记，其中12S rRNA和16S rRNA因其存在大量的插入和缺失现象且基因高度保守、进化较慢，故不宜用做条形编码基因；ND4和ND5进化太快，难以设计出通用引物，限制了它们作为全面DNA 鉴定系统的目标基因。相较于其他基因，CO I基因大小和结构较为保守，包含信息量大，能够保证足够变异的同时又容易被通用引物扩增，在物种内不同个体之间只有1%-2%的差异，而近缘种间的差异大，且具有较多的系统发育信号，更适合解析亲缘关系密切的生物类群，是使用最广泛的分子标记。