[发明专利]一种南山库蠓的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法

说明书

本发明公开一种南山库蠓的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法，其特征在于采用分子生物学DNA测序的方法获取该库蠓的COⅠ基因序列，再通过基因序列相似性比对，从而根据比对结果对该库蠓进行种类鉴定。本发明提供的南山库蠓分子鉴定方法，有利于实现其快速、准确的鉴定。

技术领域

本发明涉及昆虫物种鉴定领域，具体涉及南山库蠓的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法。

背景技术

库蠓（Culicoides Latreille, 1809）隶属于昆虫纲（Insecta）双翅目（diptera）蠓科（Ceratopogonidae），其体型微小、种类繁多、分布广泛，在全世界现有1368种、中国已知347种，并且在世界范围内还在不断发现新物种。吸血蠓是指能通过刺吸反刍动物血液来传播虫媒病原体的蠓，包括库蠓属Culicoides、蠛蠓属Lasiohelea、细蠓属Leptoconops和澳蠓属Austroconops等。在库蠓属吸血蠓中，通过蠓媒传播的病原体有蓝舌病病毒(BTV)、家畜流行性出血热病毒（EHDV）、施马伦贝格病毒（SBV）、非洲马瘟病毒（AHSV）等诸多病原体。也正因吸血蠓与医疗卫生和兽医等领域息息相关，故一旦爆发家畜流行病将造成巨大的经济损失，如欧洲就曾发生过蓝舌病（BT）和施马伦贝格病（SB）大流行，国内也在多省（云南、新疆和内蒙古等）的牛羊中检测出BTV。因此，准确鉴定疾病媒介是对蠓传疾病进行监测、防治的关键一步。

目前，在库蠓的传统形态学分类鉴别方面困难重重，一方面库蠓卵、幼虫和蛹等早期发育阶段的形态结构和肢体残缺的虫体均难以辩认，并且库蠓雌虫和雄虫鉴定昆虫程度有差别，雄性利用外生殖器和尾器等形态特征易于鉴别，而雌性分类特征少较难区分；另一方面由于库蠓表型的可塑性和遗传的可变性也容易导致误判，并且传统形态学鉴定操作过程较为繁琐且需具备较强的专业知识和丰富的实践经验。因此，亟需寻求一种快速、准确的方法，以弥补传统形态学分类方法的不足。

随着分子生物学和生物信息学的快速发展，以DNA序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用技术手段，极大地弥补了传统分类学鉴定的缺陷。DNA条形码技术是指生物体内一段标准的、有足够变异和一定保守性的、且相对较短易扩增的DNA片段。因此，作为DNA 条形码的标准目的基因，其必须满足两个条件，一是必须具有一定的保守性，便于通用引物设计及进行大范围的PCR扩增；二是要有足够的变异性，以区分不同物种，尤其是近缘种。

昆虫线粒体DNA为双链闭环分子，由ND1-6、ND4L、CO I-CO III、ATPase6、ATPase8、Cytb等13个蛋白质基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）共37个基因和包含复制启动子的非编码区段组成。CO I是目前全世界应用频率最高的分子标记，其基因大小和结构较为保守，包含信息量大，能够保证足够变异的同时又容易被通用引物扩增，在物种内不同个体之间只有1%-2%的差异，而近缘种间的差异明显，且具有较多的系统发育信号，更适合解析亲缘关系密切的生物类群，是使用最广泛的分子标记。

迄今为止，已有诸多研究证明COⅠ基因适用于绝大多数生物类群的分子鉴定，如昆虫、鸟类、鱼类、线虫等类群的分类鉴定。因此，采用COⅠ基因的DNA 条形码技术对吸血蠓进行分子鉴定。该方法与传统形态学分类方法互为佐证，不仅可实现吸血蠓的快速、准确鉴定，而且利用DNA条形码技术可帮助发现库蠓属中的隐存种或新种。目前，通过该方法已获得多种吸血蠓的COⅠ基因序列并上传至Genbank中，但至今尚无南山库蠓的COⅠ基因序列。本发明提供的南山库蠓DNA条形码标准基因序列有利于实现南山库蠓的快速、准确鉴定，缩短物种鉴定时间。

发明内容