[发明专利]肠上皮类器官无生长因子培养方法

说明书

本发明提出了一种培养基。该培养基包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N‑乙酰半胱氨酸、CHIR‑99021以及LDN‑193189。利用根据本发明实施例的培养基体外培养肠隐窝或肠干细胞，获得的肠隐窝的数量多于现有技术，获得的肠隐窝中的干细胞的比例更高，获得的肠干细胞的数量更多；并且利用根据本年发明实施例的培养基体外培养肠隐窝，可以长时间维持肠隐窝中的干细胞的干性，肠隐窝中细胞增殖更加旺盛，肠隐窝中细胞分化正常有序。根据本发明实施例的培养基利于肠上皮干细胞培养系统和肠隐窝类器官培养系统的推广，有利于肠干细胞在体外大量扩增，进而为肠道疾病的治疗提供了非常有利的平台。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及培养基及其用途，更具体地，本发明涉及培养基、CHIR-99021以及LDN-193189在制备培养基中的用途、培养肠隐窝的方法以及获得肠干细胞的方法。

背景技术

肠上皮是人体执行消化吸收功能的主要结构，它更新十分迅速，而它的更新主要是由位于其底部隐窝结构中的肠上皮干细胞所驱动的，因而对肠干细胞的研究与人体健康息息相关。近年来，肠上皮干细胞体外培养系统的建立大大推动了对肠上皮干细胞的研究，便于在体外直接对肠上皮干细胞进行操作和观察。这些体外培养的肠上皮干细胞还可以整合进入损伤后的肠上皮，帮助修复肠上皮的损伤，有希望被应用于肠道损伤疾病的治疗。

在进行小鼠小肠上皮类器官培养时，使用的培养条件为：基础培养基AdvancedDMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine,以及所需要的生长因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1。在进行单细胞培养时，需要在类器官培养基的基础上加入10uM的Blebbistatin和100ng/mL的Wnt-3a。进行小鼠结肠类器官体外培养时，需要在小肠培养基的基础上加入100ng/mL的Wnt-3a。进行人的小肠培养时需要在小鼠小肠隐窝培养基的基础上加入100ng/mL的Wnt-3a，500nM的A83-01，10uM的SB202190，1M的Nicotinamide和100uM的[Leu15]-Gastrin I。

现存的肠干细胞体外培养系统需要加入EGF、Noggin和R-spondin(ENR)或者ENR和Wnt-3a(ENRW)等生长因子，这些生长因子价格昂贵，不利于肠上皮干细胞培养系统的推广，尤其是限制了肠干细胞在体外大量扩增，用于肠道疾病的治疗。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N-乙酰半胱氨酸、CHIR-99021以及LDN-193189。根据本发明实施例的培养基采用CHIR-99021和LDN-193189替代EGF、Noggin、R-spondin和Wnt-3a等生长因子，成本较低，为不含生长因子的肠干细胞或隐窝培养；并且根据本发明实施例的培养基可以通用于小肠隐窝、结肠隐窝、单细胞以及人鼠小肠隐窝培养，方便操作。更为重要的是，发明人发现，利用根据本发明实施例的培养基体外培养肠隐窝或肠干细胞，获得的肠隐窝的数量多于现有技术，获得的肠隐窝中的干细胞的比例更高，获得的肠干细胞的数量更多；并且利用根据本年发明实施例的培养基体外培养肠隐窝，可以长时间维持肠隐窝中的干细胞的干性，肠隐窝中细胞增殖更加旺盛，肠隐窝中细胞分化正常有序。根据本发明实施例的培养基利于肠上皮干细胞培养系统和肠隐窝类器官培养系统的推广，有利于肠干细胞在体外大量扩增，进而为肠道疾病的治疗提供了非常有利的平台。

根据本发明的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述CHIR-99021的浓度为7～15μM，所述LDN-193189的浓度为100～500nM。进而培养基用于肠隐窝或肠干细胞的体外培养效率进一步提高。